同时精准编辑四个基因创造低硫代葡萄糖苷含量的亚麻荠新种质，实现营养品质改良

亚麻荠是一种低投入、高产出的油料作物，作为食品和非食品应用的作物越来越受到关注。然而硫代葡萄糖苷这种对健康有不良影响的植物代谢物的存在限制了其在人类和动物营养需求中的应用。硫代葡萄糖苷会对牲畜产生生长迟缓以及肾和肝功能受损等不良影响。亚麻荠种子中硫代葡萄糖苷含量与山茶属的其他特殊代谢物类似，具有很高的可塑性。可通过遗传育种途径予以改良。

近日，德国波恩大学植物分子生理学和生物技术研究所Peter Dörmann团队和莱布尼茨植物遗传学和作物植物研究所Jochen Kumlehn团队在植物学知名期刊Plant Biotechnology Journal上发表了一篇题为“Ablation of glucosinolate accumulation in the oil crop Camelina sativa by targeted mutagenesis of genes encoding the transporters GTR1 and GTR2 and regulators of biosynthesis MYB28 and MYB29”的研究论文。针对转录因子AtMYB28、 AtMYB28在葡萄糖苷积累过程中起着重要作用，研究人员采用了CRISPR/Cas9介导的精准突变技术，通过靶向转运体基因GTR1、GTR2，减少硫代葡萄糖苷向种子的转运，并通过靶向突变MYB28和MYB29转录因子基因，降低硫代葡萄糖苷生物合成的调节。后代分离获得了基因敲除突变体。在不影响影响品质的前提下极显著降低了硫代葡萄糖苷含量。

为了研究CsGTR1、CsGTR2和CsMYB28同源基因在不同组织中的表达，从绿色种子和野生型根（WT）中提取RNA，并使用同源基因特异引物通过定量实时PCR（qPCR）测定表达水平。与种子中的适度表达相比，所有同源基因在根中的表达更高。CsGTR1-C和CsGTR2（A，B，C）在根中的表达大约高出10倍，而CsGTR1-A和B的表达则高出100倍以上。种子中三个同源CsMYB28基因的表达也比根低约10倍。

CsGTR1-A和CsGTR2-C的PCR产物用Tsp45I酶切，CsMYB28-A PCR产物用BtgZI酶切。这两种酶的识别位点分别位于TS1或TS5中。CsMYB28的三个同源WT蛋白分别含有370个氨基酸，而CsMYB28-A、B和C同源同源基因分别含有341、342和340个氨基酸。所有这些突变导致R2R3型MYB转录因子保守结构域特征的破坏，从而导致蛋白质失活。CsMYB28同源同源基因中TS6或TS6*同时发生的进一步突变不能恢复TS5突变改变的原始蛋白质序列。

通过高效液相色谱法对csgtr1csgtr2突变体种子和根中硫代葡萄糖苷的含量测定表明种子中硫代葡萄糖苷含量。CsGTR1和CsGTR2的突变导致突变种子中硫代葡萄糖苷显著减少85%至88%，而不影响GL9、GL10和GL11的分布。然而，在亚麻荠WT的根中检测到大量GL9、GL10和GL 11，与种子相比，它们的组成不同。突变根中硫代葡萄糖苷的水平也显著降低，同时其组成也发生了变化。

利用三个CsMAM1同源同源序列中保守的引物序列，通过qPCR研究了参与脂肪族硫代葡萄糖苷生物合成的甲基硫烷丙酸合成酶1（MAM1）的表达。WT和品系G3胚胎中的CsMAM1表达相似，而csmyb28csmyb29缺失突变M4的表达低约60倍。

而且作者研究发现，亚麻荠csgtr1csgtr2和csmyb28csmyb29突变体系的种子油和蛋白质含量不受影响。通过诱变CsGTR1、CsGTR2、CsMYB28或CsMYB29获得的质量不会导致亚麻荠种子的产量损失，这一点非常重要。因此，测定了种子中的油和蛋白质含量。csgtr1csgtr2和csmyb28csmyb29种子中的含油量分别为439-459和423-457 nmol/mg，而WT种子中的油含量为429-441 nmol/mg。与WT相比，csgtr1csgtr2和csmyb28csmyb29突变种子的脂肪酸谱没有变化。此外，csgtr1csgtr2和csmyb28csmyb29突变种子分别含有234-241和204-233nmol/mg蛋白质，而WT种子含有219-239nmol/mg蛋白质。因此，亚麻荠csgtr1csgtr2和csmyb28csmyb29突变系的籽油和蛋白质含量不受影响。

尽管失去了根硫代葡萄糖苷，但亚麻荠csgtr1csgtr2和csmyb28csmyb29无效突变体中的抗毒素和其他抗菌化合物在很大程度上保持了其对病原体的抗性。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13936

转自：“iPlants”微信公众号

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