Nature Plants | CRISPR-Cas系统介导的拟南芥染色体大片段倒位造成大规模交叉抑制

CRISPR/Cas基因编辑已经彻底改变了植物生物学和育种。越来越多的工具被开发出来进行单基因或多基因的调节等，能够改变染色体上基因的顺序，也增加了一个性状控制的新层次: 遗传连锁的破坏。育种家们能够依靠亲本同源染色体之间减数分裂重组的交叉（CO）在单个品种中组合需要的性状。众所周知，染色体重排，如倒位，通过抑制重排区域的（CO）来调节沿染色体的重组格局。泛基因组研究发现，自然染色体重排在许多作物物种中普遍存在，并在驯化过程中发挥了重要作用。尽管逆序突变看似有害，但也能产生积极的影响，例如通过阻止重组来保护有利的等位基因组合。

近日，来自德国卡尔斯鲁厄大学的Holger Puchta团队在国际著名杂志Nature Plants杂志上发表了一篇题为“Massive crossover suppression by CRISPR–Cas-mediated plant chromosome engineering”的研究文章，文章报道了CRISPR/Cas基因编辑介导的植物染色体工程抑制大规模杂交。

在研究中，科研人员目的是否可以通过CRISPR/Cas介导的染色体工程从遗传交换中排除拟南芥基因组的大部分。为了从减数分裂重组中排除尽可能多的遗传信息，科研人员决定倒位几乎整个染色体，并研究倒位对 CO 频率和分布的影响。为了实现目标，我们使用了CRISPR/Cas一个完善的方案来获得拟南芥中罕见的染色体重组事件，在2号染色体端粒末端附近诱导两个双链断裂，将相邻的17.1 Mb 的片段反转过来。这只留下一个2Mb和一个0.5Mb长端粒末端在它们原来的方向（图一）。并在在细胞学层面，通过荧光原位杂交杂交(FISH)证实。

接下来，为了评估染色体重排对育性的影响，对纯合子、半合子和野生型植株进行了育性测定。发现与纯合子植物和野生型植物相比，半合子植物每角果的种子数量减少了1/3(图2b)。此外，我们在半合子植物的几个角质中观察到空的空间代替了种子。纯合子植株和野生型植株的总种子数差异不显著。然后，研究了大约十分之九的染色体倒位对2号染色体重组频率的影响，以及为了控制和比较的目的，对3号染色体重组频率的影响。与 Ler-1杂交得到纯合反转系。F1种子随后被收获。然后进行繁殖，获得 F2种子。通过对400株从 F2种子中生长出来的植株进行分析，确定了重组频率。作为对照，对400株 WT Col-0与 Ler-1杂交后代进行了分析。使用TaqMan单核苷酸多态性(SNP)基因分型测定，选择了2号染色体上的23个 SNP 标记和3号染色体上的9个 SNP 标记，以检测 Col-0和 Ler-1等位基因之间的标记变化。在2号染色体上，8个 SNP 标记位于反向区域内。在反转边界外，在5′端选择了10个SNP 标记，在3′端选择了5个SNP 标记。反转外标记之间的距离越短，端粒末端 CO 事件的分辨率越高。所分析的植株是二倍体，因此，标记分析总结了两个独立经历两次减数分裂的染色体的遗传状态。因此，我们首先分析了每个样本中是否存在标记变化。

在“倒位X Ler-1”(Inv X Ler-1)系的后代中，检测到与 Col-0 X Ler-1对照相比，倒位区域内的标记变化大大减少。在反向区域内检测到32个标记变化，而在同一区域的Col-0 X Ler-1对照品系中检测到386个标记变化。这相当于在 Inv X Ler-1反向区域重组事件减少了大约92% (图3a，b)。比较Inv X Ler-1系和对照中在倒位区域外检测到的标记变化的总数，作者发现标记变化的总数在5’端粒末端增加了约1.5倍，在倒位线的3’端粒末端增加了2倍(图3a，b) ，指向CO向端粒末端的转移作为倒位的结果。总的来说，在2号染色体上的400个样本中检测到了206个标记变化。由于CO只需要出现在二价染色体的两个姐妹染色单体中的一个就可以确保正确的分离，因此可以预期大约四分之一的二倍体后代植株会显示出CO的缺乏（图二）。

研究表明，不仅基因，而且整个染色体可以使用CRISPR/Cas基因编辑的Cas9蛋白进行工程化。染色体重组在植物育种中应用的一个主要目标是遗传交换的操作。本研究表明，利用染色体重组可以在几乎整个染色体中抑制减数分裂重组。具体实施是通过诱导一个大于 17Mb长的染色体片段的可遗传倒位，该片段含有着丝粒并且覆盖了拟南芥生态型 Col-0的大部分2号染色体。只有2 Mb和0.5Mb长的端粒末端保持原来的方向。在生态型 Ler-1杂交后代的单核苷酸多态性标记分析中，我们检测到在倒置染色体区域内杂交大量减少，同时杂交转移到端粒末端。在倒位中检测到的少数遗传交换均起源于双交换。这不仅表明可遗传的遗传交换可以通过间质染色体配对发生。

总的来说，在真核生物中，通过CRISPR/Cas介导的染色体工程抑制染色体水平的重组是可能的。能够为不断增长的基因组工程工具箱开发一种新的工具，允许以预先设计的方式抑制基因组中任何地方的重组。这种方法在真核生物中应该是普遍可行的。此外，作者研究表明，有可能几乎完全取消重组在几乎整个染色体代表拟南芥基因组的一个重要组成部分。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41477-022-01238-3

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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