北京时间2022年9月26日晚23时，浙江大学基础医学院生物物理学系的杨帆团队、郭江涛团队、杨巍团队和深势科技的温翰团队在Nature Chemical Biology杂志上合作发表了研究论文“Structural mechanisms of TRPV2 modulation by endogenous and exogenous ligands”。
该研究发现细胞膜的重要组成分子-胆固醇，是TRPV2通道的内源性抑制剂；而TRPV2的经典外源性激动剂2-APB，和胆固醇分子竞争结合同一个位于跨膜区的口袋。胆固醇与2-APB分别引起TRPV2通道S4-S5 linker的内移和外摆，从而抑制或激活该通道。
TRPV2离子通道是瞬时受体电位（TRP）通道香草醛（Vanilloid）亚家族中的重要成员。TRPV2通道具有目前已知最高的温度激活阈值，可以被超过50℃的高温激活；TRPV2和TRPV1、TRPM8等人体温度感受TRP通道的发现者David Julius教授、Ardem Patapoutian教授获得了2021年诺贝尔生理学或医学奖。但是，人们对TRPV2的生理病理作用的认识尚待深入。例如，TRPV2通道是否受到内源性分子的调控，其外源性激动剂是如何结合并激活该通道，都是尚未回答的科学问题。
与常规基于质谱的结合分子发现的研究范式不同，该研究团队首先通过单颗粒冷冻电镜技术，在不添加胆固醇或其类似物的条件下，解析了小鼠TRPV2通道的高分辨率三维结构（mTRPV2CHL, 3.2 Å）。研究人员对该结构进行分析，发现在跨膜区由S4、S5和S4-S5 linker等形成Vanilloid Binding Pocket（VBP）中，出现了一个与胆固醇分子十分类似的电子云密度。环糊精（MβCD）可以去除细胞膜上的胆固醇，为了验证该密度是否为胆固醇分子，研究人员在纯化TRPV2蛋白过程中用环糊精进行处理。经过环糊精处理的TRPV2冷冻电镜结构中（mTRPV2MβCD, 2.9 Å），VBP里面没有观察到mTRPV2CHL结构中类似胆固醇分子的电子云密度。在后续实验中，研究人员在环糊精处理的TRPV2蛋白加入外源胆固醇，又可以在VBP中看到类似胆固醇的电子云密度。因此，研究人员确信细胞内源性胆固醇分子可以结合在TRPV2通道的VBP。
1. 内源性胆固醇分子（红色）结合在小鼠TRPV2通道的VBP口袋。
VBP是TRP通道上经典的调控分子结合口袋，例如在TRPV1通道上，辣椒素、RTX等分子均结合在VBP。因此，研究人员推测胆固醇在TRPV2通道的VBP结合也能发挥调控作用。通过使用膜片钳电生理记录，研究人员发现，胆固醇或其可溶性更高的类似物CHS均能很好抑制TRPV2的配体激活，其IC50在微摩尔水平（74.6 ± 25.1 µM）。胆固醇在血液与细胞膜中的浓度可以高至数百微摩尔乃至毫摩尔，故研究人员推测，体内的TRPV2通道可能处于长期被胆固醇抑制的状态。
从mTRPV2CHL结构上，可以看到胆固醇分子的羟基与TRPV2通道S4-S5 linker上的Q525位点接近，并且电子云密度图上可以观察到疑似水分子的电子云密度，进而通过全原子分子动力学模拟，证实了通过胆固醇和Q525通过水分子会形成局部氢键网络帮助结合。研究人员通过在TRPV2的VBP引入大量的点突变并进行电生理记录，发现Q525F与Q525T两个点突变都可以完全消除胆固醇分子的抑制作用。研究人员进一步解析了这两个点突变TRPV2通道的三维结构（mTRPV2Q525F，2.6 Å；mTRPV2Q525T，2.5 Å ），阐明了突变影响胆固醇作用的机制。
研究人员进一步发现，雌二醇作为胆固醇的衍生物，不仅不抑制TRPV2通道，反而可以增强TRPV2的经典外源性激动剂2-APB分子的作用。研究人员解析了单独加入雌二醇（mTRPV2E2, 2.8 Å）、雌二醇与2-APB共同加入（mTRPV2E2_A-APB, 3.3 Å）以及环糊精处理后单独加入2-APB（mTRPV2MβCD_2-APB, 2.8 Å）三种状况下TRPV2通道的高分辨率三维结构。通过结构比较，发现雌二醇影响了胆固醇的结合，而且2-APB分子也结合在VBP口袋。通过在VBP口袋引入点突变，在电生理记录中可以看到2-APB的激活被完全消除，进一步验证了2-APB的结合方式。
在这一系列TRPV2结构的基础上，研究人员进行了全原子和粗粒化的分子动力学模拟。通过模拟，发现胆固醇和2-APB都可以稳定地结合在VBP，但是2-APB分子离开VBP口袋时，需要跨越较高的能垒，所以其结合更稳定。这就解释了在活细胞中，虽然内源性胆固醇分子占据了VBP口袋，但是2-APB的加入仍然可以竞争该口袋并激活TRPV2通道。
总之，通过综合使用单颗粒冷冻电镜技术、单细胞膜片钳电生理记录和分子动力学计算模拟，研究人员不仅发现了TRPV2通道的新型内源性调控分子胆固醇，也揭示内源性、外源性分子抑制或激活该通道的作用机制。
浙江大学基础医学院生物物理学系博士后苏楠楠、博士研究生甄文轩和张恒为该工作的共同第一作者。浙江大学基础医学院生物物理学系的杨帆研究员、郭江涛研究员、杨巍教授和深势科技的温翰博士为共同通讯作者。
本研究得到了国家自然基金委和浙江省自然基金委的资助，浙江大学冷冻电镜中心为本研究提供了冷冻电镜支持。阿里巴巴-浙江大学未来数字医疗联合研究中心（AZDH）为本研究提供了阿里云资源支持。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1038/s41589-022-01139-8
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