CR (IF=46) | 中国科学院李劲松/裴钢构建具有人工核型的小鼠证明基因组组织的稳定性

Robertsonian（ Rb) 融合有助于物种核型的多样性。然而，它是如何发生和推动进化的仍然未知，主要是由于缺乏一种简单有效的方法来对动物染色体进行基因操作。

2022年9月20日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）李劲松及裴钢等多团队合在在Cell Research杂志在线发表题为“Creation of artificial karyotypes in mice reveals robustness of genome organization”的研究论文。该研究通过 CRISPR-Cas9 诱导，成功切割精子样干细胞中的 MinSat 重复序列，生成了具有中着丝粒染色体的小鼠模型，为证明次要卫星中断点的发生是中着丝粒种族自然衍生的基础提供了直接证据。

有趣的是，由于显著的DNA 损伤反应诱导的胚胎发育停滞，受精卵注射靶向 MinSat 的 CRISPR-Cas9 不能产生具有 Rb 融合的小鼠。这些结果表明，配子中Rb 融合的预先存在可能是天然存在的染色体减少的小鼠品系的原因。因此，类精子干细胞介导的半克隆技术为研究染色体结构在核型进化中的功能提供了实验平台。

典型的小鼠核型 (2n = 40) 除了 Y 染色体 (chromosome Y, ChrY) 外完全是端着丝粒，而西欧亚种 M. m.家蚕包含多种染色体系列，由于携带一对或多对中着丝粒染色体，二倍体数量在 38 和 22 之间变化，这是由两个端着丝粒染色体之间的 Rb 融合产生的。因此，在实验室中重述这一过程可能有助于阐明关于 Rb 融合在进化中的作用。

先前的研究表明，Rb 融合诱导的中着丝粒染色体具有夹在两个大的主要卫星 (major satellite, MajSat) DNA 块之间的小卫星 (minor satellite, MinSat) 新着丝粒区域。这些观察表明 Rb 融合断点位于着丝粒区域的 MinSat 序列内。

小鼠 MinSat 单体在不同染色体之间高度同质，由 120 bp 单体单元的串联重复组成，并且仅定位于除 ChrY 6 之外的所有染色体的着丝粒。鉴于 CRISPR-Cas9 介导的染色体工程已通过头对尾策略成功融合 16 条酵母染色体，从而产生具有 1 或 2 条染色体的酵母菌株，研究人员假设 CRISPR-Cas9 介导的通过靶向 MinSat 序列的染色体工程可以是在实验室中创建染色体数量减少的小鼠品系的理想策略。

在这项研究中，研究人员设计了 5 个针对着丝粒 MinSat 中不同区域的 sgRNA，称为 CENsg1-CENsg5，然后将 Cas9 mRNA 和 5 种 sgRNA 中的每一种直接注射到受精卵中，发现所有 5 种 sgRNA，即使在低浓度下，也会损害卵裂球分裂并导致胚胎早期发育停滞，这可能是由于注射的受精卵原核中 DNA 损伤反应 (DNA damage response, DDR) 显著增加。

仅携带精子基因组的小鼠雄激素单倍体胚胎干细胞（AG-haESCs，也称为类精子干细胞）可用于 CRISPR-Cas9 介导的基因操作，从而产生具有相应的半克隆小鼠（semi-cloned mice, SC小鼠）通过胞浆内注射到卵母细胞 (intracytoplasmic injection into oocytes, ICAHCI) 一步完成遗传特征。

通过将 CRISPR Cas9 和 CENsg 转染到单倍体细胞（一种称为 O48 的细胞系，可以有效地支持SC小鼠生成），研究人员观察到与注射受精卵中的DNA损伤信号相比要弱得多。核型分析显示，虽然 > 97% 的细胞维持正常核型，但其余细胞携带染色体融合，其中超过一半是可能导致中着丝粒染色体的非同源 Rb 融合。这些结果表明 CRISPR-Cas9 介导的着丝粒 MinSat 切割可以成功地诱导精子样干细胞中两个端着丝粒染色体之间的头对头融合。

总的来说，这项研究将染色体工程策略与HiC技术相结合，生成具有相同遗传背景的单倍体细胞和小鼠文库，这些文库由染色体融合的不同组合组成，包括具有所有中着丝粒染色体的小鼠品系。这些资源可用于全面研究细胞和动物中染色体结构的功能，模拟染色体结构变化引起的细胞核中的染色体运动，从而为研究活细胞中染色质结构的功能提供实验平台。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41422-022-00722-x

转自：“iNature”微信公众号

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