DEV CELL |提高拟南芥盐胁迫耐受性的Ca2+传感器

世界上有超过8亿公顷的盐碱化土地，超过世界总土地的6%，大多数盐碱化土地是由自然原因造成的。盐胁迫是农业中的一个主要问题，越来越多的耕地因Na+浓度增加引起作物减产。盐胁迫是由 Na+离子的离子毒性和渗透扰动引起的，耐盐机制是通过体内渗透调节排出或分隔Na+降低其毒性。植物对Na+浓度升高的一种直接反应是细胞质 Ca2+浓度的升高， Ca2+信号通过盐过度敏感SOS 途径以赋予植物耐盐性。在该通路中，钙调神经磷酸酶B (CBL) Ca2+传感器SOS3/CBL4与蛋白激酶 (CIPK) SOS2/CIPK24相互作用，磷酸化并激活质膜上的Na + / H +逆向转运蛋白SOS1将Na+排出细胞外。在自然环境中，土壤含水量的快速变化会显著改变Na +的浓度。Na+的这种快速变化是否被植物信号快速响应，以及植物 SOS 途径是否可以通过调整其活性以响应不断变化的盐胁迫强度仍不清楚。

近日，德国明斯特大学Jörg Kudla教授课题组在DEVELOPMENTAL CELL期刊上发表了题为“A Ca2+-sensor switch for tolerance to elevated salt stress in Arabidopsis”的文章，通过Ca2+荧光标记蛋白来研究模式植物拟南芥根系中钙信号的传递，发现Na+胁迫会在根分化区内特异性地触发初级钙信号，从而在拟南芥中形成一个“钠敏感生态位”。

作者利用延时成像分析技术对 Ca2+荧光标记报告蛋白 YC3.6在拟南芥根中的瞬时信号进行观察，发现Na+可以诱导初级 Ca2+信号 (PCS)的产生，并且盐胁迫的强度由局部 Ca2+信号的幅度和产生 Ca2+波的速度来反映（图1）。作者利用可以造成相同渗透压力的75 mM NaCl 或 150 mM甘露醇处理根时发现PCS响应仅由NaCl 应激的离子成分引起（图1 B）。为了进一步研究 PCS 形成的机制，利用NaCl梯度进行处理发现刺激强度越大达到最大 Ca2+反应的时间越短，并且强度随NaCl浓度升高而增强（图1D-E）。

为了鉴定除了 CBL4/SOS3 以外在耐盐性中起作用的 CBL 型 Ca2+传感器，作者在50 至 150 mM NaCl 的盐胁迫条件下筛选了所有 10 种拟南芥CBL的突变体，与野生型 (WT) 相比，cbl8突变体幼苗在 150 mM NaCl 培养基上的存活率降低。在烟草中超表达CBL8，发现OE 品系的盐胁迫恢复能力增强，表明CBL8是植物对高盐度耐受性的特定关键正调节因子。

在盐敏感酵母菌株 AXT3K中发现 CIPK24是唯一可激活 Na + /H +反转运蛋白SOS1的CIPK蛋白（图3 A）。通过酵母双杂系统筛选可与CBL8 相互的CIPK蛋白，发现CIPK24可与CBL8相互作用。

CBL8 与 CIPK24 和 SOS1在酵母和人 HEK293T 细胞中的共表达重构了另一种 SOS 途径（图3 D），在含 NaCl 的培养基上盐敏感性 YP890 酵母菌株中共表达SOS1 与空载体、CBL4 或 CBL8 无法生长。CIPK24 与 SOS1 的共表达可在 100 mM NaCl 的生长。CBL4-CIPK24 和 SOS1 的组合可在含有 200 mM NaCl 的培养基生长。CBL8 替换 CBL4 建立了相似程度的耐盐性。这些数据表明，CBL8 可以作为酵母中 SOS 途径的有效成分。作者在人类 HEK293T 细胞中使用pH 比率传感器 pH-GFP 来表示 Na + 转运SOS1 的活性，在没有 SOS1 的情况下，CBL4 和 CIPK24 的共表达不会调节 HEK 细胞的转运活性，CBL4-CIPK24或 CBL8-CIPK24 与 SOS1 的共表达导致 SOS1 的转运活性显著增强（图3 E）。采用无创显微测试技术 (NMT)观察WT 和过表达拟南芥CBL8的烟草根部的离子通量，发现与 WT 相比，用 100 mM NaCl 处理 24 小时的 CBL8 过表达幼苗的 Na +流出显著增强。表明 CBL8通过增强SOS1的转运活性以提高植物耐盐性。

由于CBL4 和 CBL8 都可以在酵母和人类细胞中重建 SOS 途径——但拟南芥 cbl4突变体仅对中等 Ca2+信号的盐胁迫水平敏感。作者通过微量热泳动 (MST)技术 分析了重组 CBL4 和 CBL8 蛋白的 Ca2+依赖性结构变化，发现 CBL4 没有热泳动特性的变化，而增加Ca2+会导致CBL8 的热泳动特性发生变化。结果表明，仅有 CBL8在生理范围内响应Ca2+ 的变化而表现出结构重排。为了测试 Ca2+诱导的 CBL8 和 CBL4 结构变化是否影响它们与 CIPK24 结合的差异，利用酵母双杂技术，发现Ca2+浓度增加后，CBL8与CIPK24结合能力显著减弱而CBL4与CIPK24结合能力无变化（图3 B）。表明CBL8-CIPK24复合物的形成和/或活性受Ca2+浓度变化的影响。

为了阐明 CBL4 和 CBL8 之间的进化关系，作者对CBL4 和 CBL8 相关氨基酸序列进行系统发育分析。发现单子叶植物仅含有编码 CBL4 型蛋白而缺乏CBL8型 Ca2+传感器蛋白，双子叶植物的 CBL 序列形成了两个明显分离的进化枝，分别代表特定的 CBL4 和 CBL8 组。大多数双子叶植物的基因组含有带有 MGCXXY/T 基序的 CBL4单拷贝和带有 S-酰化基序的CBL8单拷贝。这些数据表明单子叶植物中普遍缺乏 CBL8 型 Ca2+传感器，而双子叶植物进化早期CBL4 和 CBL8发生了基因复制，随后发生结构和功能多样化，在双子叶植物的进一步进化过程中保留了这种机制。

综上所述，作者将 CBL8 确定为一种额外的与 CIPK24 相互作用的 Ca2+传感器，它对植物的耐盐性至关重要，尤其是在 NaCl 浓度升高的情况下。CBL4 和 CBL8通过与激酶 CIPK24 相互作用，响应不同的盐离子浓度胁迫。除了 CBL4/CBL8 介导的SOS途径激活外，CIPK24 的活性也直接通过磷酸转移或与其他蛋白质的相互作用进行调节。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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