NBT（IF=68）| 突破传统限制！刘如谦团队开发改造Cas9，扩大可靶向范围同时实现高效的基因编辑

CRISPR–Cas9 推动了基因组操作技术的发展，这些技术改变了生命科学，并将遗传疾病的新疗法推向临床。Cas9 参与的目标位点必须包含一个 protospacer 相邻基序 (protospacer-adjacent motif, PAM)，该基序在单向导 RNA (sgRNA) 结合之前通过蛋白质-DNA 相互作用识别。

尽管存在具有不同原型间隔区PAM相容性的 Cas9 变体，但一些基因组位点——尤其是那些具有富含嘧啶的 PAM 序列的基因组位点——仍然无法被高活性 Cas9 蛋白访问。此外，通过工程扩大 PAM 序列兼容性会增加脱靶比例。

2022年9月8日，美国哈佛大学Broad研究所和霍华德休斯研究所刘如谦（David Liu）团队与波士顿大学Ahmad S. Khalil团队合作在Nature Biotechnology （IF=68）在线发表题为“High-throughput continuous evolution of compact Cas9 variants targeting single-nucleotide-pyrimidine PAMs”的研究论文。该研究通过定向进化，生成了四种 Cas9 变体，它们共同能够靶向人类基因组中大多数富含嘧啶的 PAM 序列。改造后的Nme2Cas9突变体成功突破了传统PAM（N4CC）的限制，可有效识别N4YN类型的PAM并实现高效的基因编辑。

CRISPR–Cas9 推动了基因组操作技术的发展。虽然对某些基因编辑应用（例如靶基因破坏）并不排斥，但这种 PAM 要求限制了精确基因编辑方法的适用性，包括碱基编辑、初始编辑或位点特异性 DNA 整合。对于这些技术，目标修改必须发生在 PAM的特定距离或特定范围内。因此，与在哺乳动物细胞中保持强大活性的Cas 蛋白相容的 PAM 序列的可用性强烈地决定了精确基因编辑的应用范围。事实上，最近在体外和体内治疗性碱基编辑以挽救小鼠的镰状细胞病和早衰，使用进化或工程化的Cas9 变体将碱基编辑器分别精确定位在 CACC 或 NGA PAM（其中 N 是 A、C、G 或 T）。

该研究通过定向进化 Nme2Cas9 ，将其PAM 范围从野生型蛋白质的 N4CC要求扩展到包括大多数 N4YN序列，其中 Y是 C 或 T。为了实现这种非SpCas9 的进化ortholog，研究人员开发并集成了三种技术。首先，研究人员建立了一个新的、通用的选择策略，需要PAM 识别和功能编辑活动。然后通过使用噬菌体辅助非连续进化(phage-assisted non-continuous evolution, PANCE) 和高通量 eVOLVER 启用噬菌体辅助连续进化 (eVOLVER-enabled20 phage-assisted continuous evolution, ePACE) 平台，在单个PAM 序列中并行进行选择。最后，开发出一种高通量碱基编辑依赖性PAM 分析分析 (base editing-dependent PAM-profiling assay, BE-PPA)，以快速、彻底地表征不断发展的 Nme2Cas9 变体并指导进化轨迹。

通过定向进化，该研究进化出了四种 Nme2Cas9 变体：eNme2-C、eNme2-C.NR、eNme2-T.1 和eNme2-T.2，它们可以在 PAM 上使用单个指定的嘧啶核苷酸进行稳健的精确基因组编辑。进化的Nme2 变体表现出与 SpRY（唯一能够访问类似 PAM 的其他工程变体）相当的（eNme2-T.1 和 eNme2-T.2）或更稳健的（eNme2-C）碱基编辑和更低的脱靶编辑。变体 eNme2-T.1 和 eNme2-T.2 提供对 N4TN PAM 序列的访问，具有与现有变体相当的编辑效率，而 eNme2-C 和 eNme2-C.NR 提供限制较少的 PAM 要求，在各种N4CN PAM 序列的人类细胞类型和较低的脱靶活性。

总之，这些新变体提供了广泛的 PAM 可访问性，这是对以前由 SpCas9 衍生变体靶向的 PAM的补充。此外，本研究中开发的选择策略具有高度可扩展性和通用性。由于缺乏目标位点要求，这种选择原则上可用于发展任何 Cas 直向同源物的功能活动或优化特定 PAM 或目标位点的编辑。

参考消息：https://www.nature.com/articles/s41392-022-01128-2

转自：“iNature”微信公众号

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