PBJ | 一种基于CRISPR的侧向层析测定（LFA）技术可用于植物基因分型和病原检测

近日，沙特阿拉伯基因组工程与合成生物学实验室的研究人员在知名期刊Plant Biotechnology Journal上发表了一篇题为“A CRISPR-based lateral flow assay for plant genotyping and pathogen diagnostics”的文章，该文章介绍了一种可用于田间的侧向层析测定工具——Bio-Scan，介绍了该工具在作物育种、植物转基因、植物合成进化和植物病害快速检测等方面的应用前景。

通过聚合优良等位基因或者基因工程技术加速作物改良，提高作物生长速率及生物逆境、非生物逆境的抗性，对保证全球粮食安全十分重要。依靠传统方法（如视觉观察、显微观察、免疫学测试、多态性标记分型等）对优异等位基因筛选、鉴定抗性基因或者进行耐药性检测，都存在方法复杂、耗时费力等缺点。因此，开发一种简单、精确且快速的检测方法来评估突变品系或确认优异等位基因是否在每个育种品系和世代中存在，对于定向进化和定向育种十分有必要。Bio-SCAN是最近开发一种基于CRISPR的快速检测方法，该方法仅需要sgRNA和重组生物素标记的核酸酶失活版本的Cas9（bio-dCas9）就可以用市面上已有的耦合了亲和链霉素-生物素系统的LFA试纸来检测由RT-RPA产生的一步式FAM标记的扩增子。

以小麦抗性基因Lr34为例（下图），第11个外显子上3bp的缺失导致2个氨基酸的改变（图A）。依据Cas9-sgRNA RNP 复合体与靶点结合的规则，将Lr34抗性基因3bp缺失整合到靠近PAM的目标种子区，设计特异靶向Lr34抗性基因的sgRNA （图B）。接下来，在Lr34基因座的靶区侧翼设计一对引物，生成与PCR和RPA反应兼容的fam标记扩增子。同时提取抗性品种和感病品种的DNA作为模板扩增Lr34序列，并在Bio-SCAN平台上检测。如图C所示，Bio-SCAN精确地检测到抗性品种Kariega中抗性Lr34等位基因的存在。将以RPA为基础的快速分离扩增技术与Bio-SCAN结合可以进一步加快检测速度（图D）。

本文作者使用Bio-Scan成功地对小麦抗性等位基因Lr34、Lr67，水稻合成突变体SGR3、SGR5和OsmALS；转基因启动子Ubiquitin和花椰菜花叶病毒（CaMV）35S进行了检测。同时在本氏烟草中对番茄黄叶曲病毒（TYLCV）、烟草花叶病毒（TMV）和马铃薯Y病毒(PVY)的传播进行检测；还进行了小麦真菌，纹状芽孢杆菌和木兰花菌（MoT），细菌病原体假单胞菌和肿瘤农杆菌在烟草中的检测。

Bio-SCAN可以在一小时内完成从样品分离到结果输出的全部过程，具有高灵敏度，可以精确识别优良种质，可用于突变、转基因以及病原菌检测。Bio-SCAN这种种高度敏感的、低成本、且易于使用的方法，可以加快作物育种、植物基因编辑、转基因检测和植物病原体的早期诊断，提高作物产量和粮食安全。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13924

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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