CRISPR 是细菌长期演化过程中的一种适应性「免疫系统」。当病毒入侵时，细菌可以捕获外源遗传物质的片段并将其整合到自身基因组的 CRISPR 序列中，随后通过 Cas 核酸酶精准切断病毒的 DNA，从而抵御病毒入侵。
自从十年前，两位科学家首次证实 CRISPR-Cas9 可以在活细胞内编辑基因组以来，CRISPR 便开创了自己的时代。越来越多的临床科学家投入到基于 CRISPR-Cas9 技术的活细胞疗法中。CRISPR 基因组工程在原代人类细胞中引入靶向序列替换或插入的能力在研究突变基因、纠正遗传疾病和重新编程细胞治疗方面已被证实具有巨大的前景。最近，基于 CRISPR-Cas9 的第一个治疗应用已进入临床试验阶段。
然而，CRISPR-Cas9 并非是完美的，仍面临着诸多挑战。例如，在经典 CRISPR-Cas 系统中，研究人员必须依靠病毒载体（不含致病成分的病毒外壳）将用于基因治疗的 DNA（DNA 模板）带到细胞中。因此，制造大量临床级病毒载体一直是细胞疗法的主要瓶颈。此外，使用病毒载体的成本高昂且耗费资源；而且，研究人员也无法轻松控制传统病毒载体在基因组中插入基因的位点。
2022 年 8 月 25 日，发表在 Nature Biotechnology 上的一项新研究中，来自格莱斯顿-加州大学旧金山分校基因组免疫学研究所所长 Alex Marson 领导的研究团队开发改进版的 CRISPR-Cas9 基因编辑技术解决了上述问题，该方法不需要病毒载体即可非常高效地将长 DNA 序列精准引入细胞基因组中的位点，而且可以一次设计超过 10 亿个细胞，这远远多于治疗单个患者所需的细胞数量。该研究成果是向下一代安全有效的细胞疗法迈出了一大步。
多年来，该团队的目标之一就是以一种不依赖病毒载体的方式将冗长的 DNA 指令插入靶基因位点。Marson 表示，使用非病毒基因工程方法的一个主要好处是不受成本、制造复杂性和供应链挑战的限制。
2015 年，Marson 团队与 CRISPR 先驱 Jennifer Doudna 教授（2020 年诺贝尔化学奖得主）实验室合作，首次证明可以在没有病毒载体的情况下将短 DNA 模板插入免疫细胞，并使用脉冲电场让细胞的外膜更具渗透性。
到了 2018 年，他们开发了一种不需要病毒载体的 CRISPR-Cas9 基因组靶向系统，允许在原代人类 T 细胞基因组的特定位点快速有效地插入更长的 DNA 序列（大于 1kbp）的同时保持细胞活性和功能。
然后，在 2019 年，该团队发现，通过使用一种可以与 Cas9 酶结合的改进版 DNA 模板，他们可以更有效地将新序列传递到靶基因位点，但还需要更多的工作来提高工程化免疫细胞的产量，并使这一过程与未来细胞疗法的制造兼容。
这些目标推动了当前的研究。现在，该团队不仅开发了新的技术，还展示了该技术如何被用来生成具有抗击多发性骨髓瘤（一种血癌）潜力的 CAR-T 细胞，以及改写可能导致罕见遗传性免疫疾病的基因序列。
众所周知，DNA 可以以单链或双链的形式存在，而 Cas9 靶序列（CTS）附着在双链 DNA（dsDNA）上。由于高水平的双链 DNA 模板会对细胞产生毒性，因此，老方法只能用于少量的模板 DNA，从而导致效率低下。
该团队发现，即使在相对较高的浓度下，单链 DNA（ssDNA）的细胞毒性也较小。因此，在这项新研究中，他们描述了一种将修饰的 Cas9 酶连接在单链模板 DNA 上的方法，即只需在分子末端添加少量的双链 DNA。
这给了科学家们一个平衡且两全其美的方法。与较早的双链方法相比，单链模板 DNA 可以使基因编辑的效率提高一倍以上。分子的双链末端让研究人员可以使用 Cas9 来增强非病毒载体进入细胞的能力。
在这项新研究中，研究人员使用新的 DNA 模板生成了超过 10 亿个靶向多发性骨髓瘤的 CAR-T 细胞，远远超过治疗单个患者所需要的细胞数量。CAR-T 细胞是一种经过基因改造的免疫 T 细胞，可以有效地对抗特定的细胞或癌症。使用新的单链 Cas9 定向模板，大约一半的 T 细胞获得了新的基因，并因此被转化为 CAR-T 细胞。
Marson 表示，将 DNA 模板定位到基因组中的一个特定位置（TRAC 位点）将提高 CAR-T 细胞的抗肿瘤效力。这种新的非病毒方法使他们可以更有效地实现靶向，这将加速下一代 CAR-T 细胞疗法的发展。
此外，该团队首次表明，他们的方法可以完全替代与罕见遗传性免疫疾病相关的两个基因，即 IL2RA 和 CTLA4 基因。
在过去的研究中，科学家们已经证明可以在个别患者发生突变的 IL2RA 基因中替换一小片段。现在，该团队证明，他们可以一次性替换整个 IL2RA 和 CTLA4 基因，这种「一刀切」的方法可以治疗许多这类患者，而不必为每个患者的突变生成个性化模板。研究人员发现，用这种基因工程方法处理的细胞中，近 90% 获得了健康版本的基因。
Marson 表示，这种新方法有有望使新的细胞和基因疗法更好、更快、更便宜。目前，该团队正在推进 CAR-T 细胞治疗和在 IL2RA 缺陷的患者中使用非病毒载体 CRISPR 技术的临床试验。
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-022-01418-8
https://doi.org/10.1073/pnas.1512503112
https://www.nature.com/articles/s41586-018-0326-5
https://www.nature.com/articles/s41587-019-0325-6
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