NC | 可诱导的多靶标调控基因表达的CRISPR/Cas系统

近日，英国伦敦帝国理工学院合成生物学中心Rodrigo Ledesma-Amaro团队在Nature Communications在线发表了题为“Inducible expression of large gRNAarrays for multiplexed CRISPRai applications”的研究论文。该文章开发了一种可诱导的多靶标调控基因表达的易于使用的CRISPRai工具和gRNA的组装策略。将该系统用于工业酵母这一在受多基因调控的系统中，可以很好的调控相关基因的表达，最终使琥珀酸的产量提高了45倍。

基因的调节控制着细胞复杂的生命活动。人为控制基因的表达（包括激活和抑制）使我们能够对细胞进行“重编程”，以增强我们对细胞复杂生命活动的理解，最终辅助人们控制细胞执行所需的细胞学功能，例如生物技术和应用生物医学所需的功能。近年来，随着生物技术的发展，CRISPR基因激活 (CRISPRa) 和抑制 (CRISPRi) 已成为调节内源基因表达的强大合成工具。多个靶基因的协同激活和抑制使我们能够更加真实的研究基因的转录调控并改变细胞活动。由于在代谢工程中代谢过程必须重新按照人们的需求合成所需的产物，因此在代谢工程中CRISPRai尤其重要。

可诱导性是转录调控方法的一个重要特征。众所周知，基因长期受到转录扰动会产生适应性转录本，导致遗传的不稳定性和表型的缺失。此外，必需基因的调节是难以持续的，因为其错误表达会严重影响细胞生长。当靶向此类基因时，CRISPRai 的可诱导性将提高靶向的稳定性并降低对靶标选择的严格性。迄今为止，仅单独针对 CRISPRa 或 CRISPRi 分别证明了gRNA对多靶标CRISPR 调控的可诱导性。因此，为了发挥 CRISPRai 的全部潜力，一个可以同时激活和抑制许多基因并且按照人们需要“适时开启”的系统是必要的。这会加速我们研究和改造细胞的能力。

为了创建可诱导的多顺反子gRNA，作者在之前的工作的基础上，从一个组成的、Pol II驱动的RNA转录本中组装和表达多个gRNA，然后使用dCas9-Mxi1通过Csy4内切酶进行多靶标的CRISPRi。诱导型 gRNA在未诱导状态下消除了几乎所有不需要的 CRISPRi 抑制。在不加aTc（脱水四环素）时，系统未被诱导，在此情况下报告基因具有对照表达的 96-98%，证明此时gRNA被 mutTetR-Mxi1有效的沉默（图1d)。在添加 1微摩尔aTc 后 mutTetR-Mxi1释放，系统处于诱导状态，这导致诱导后荧光蛋白表达的变化高达 111 倍。

在使用 CRISPRi（基因抑制）开发了诱导型 gRNA方法之后，我们接下来引入了一种 CRISPRa（基因激活）蛋白来完成诱导型 CRISPRai 工具的开发。在前人的基础上，我们引入了来自毛螺菌科细菌的核酸酶缺陷型Cas12a，进而与VP转录激活域融合，最终发挥转录激活（dCas12a-VP）的作用。代谢工程是诱导型 CRISPRai 工具包在酵母中的主要应用场景，接下来作者评估了该系统在酵母培养中随着时间的推移如何发挥作用，旨在随着时间的推移实现稳定靶基因的激活和抑制。作者设计了一个实验来抑制和激活荧光报告基因的表达，并在诱导后每隔 24 小时测量一次输出。诱导后 1 天，mScarlet-I 表达增加 800%，mTagBFP2 表达减少 90%。之后，基因的抑制和激活稳定维持了五天以上（图2b）。此外，在一周时间的细胞传代过程中，gRNA在未诱导状态下保持稳定，从而避免了在实验开始之前可能的表型损失。在诱导状态下，分批培养 2 天后，靶向菌株的琥珀酸产量比 WT 菌株增加45倍（WT为9.38 ± 5.7mg/L，靶向诱导为 426.9 ± 13.3mg/L)，与未诱导的靶向菌株 (26.4 ± 0.5mg/L) 相比，琥珀酸的变化为16倍。

总而言之，该系统为加速构建酵母代谢工程的更广泛、灵活和更快的菌株构建打开了大门。最后，这里介绍的可诱导性的基本方法应该适用于其他物种，并可以扩展到其他 CRISPR/Cas 系统。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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