Plant Cell | 重庆大学邓伟研究团队揭示生长素与脱落酸拮抗调节番茄抗坏血酸产生的分子机制

番茄是全球最具价值的作物之一，也是研究果实发育和成熟的理想模型。番茄果实是抗氧化剂的主要膳食来源，例如胡罗卜素，类黄酮和抗坏血酸等。抗坏血酸(Ascorbic acid , AsA)也是人们常说的维生素C，是一种多功能植物营养素，有着提高免疫力，预防心血管疾病等作用，对人类饮食与植物发育至关重要。但在番茄果实中，抗坏血酸的合成与代谢途径仍然知之甚少。

2022年8月24日，重庆大学生命科学学院邓伟教授研究团队在植物顶级杂志The Plant Cell在线发表了题为“Auxin and abscisic acid antagonistically regulate ascorbic acid production via the SlMAPK8–SlARF4–SlMYB11 module in tomato”的研究论文，该研究发现番茄果实中的抗坏血酸积累受到生长素与脱落酸通过丝裂原活化蛋白激酶、生长素反应因子和MYB转录因子的拮抗调节。

为了研究生长素对抗坏血酸(Ascorbic acid , AsA)积累的影响，作者测量了果实发育不同阶段的总AsA含量与AsA含量变化，同时利用生长素响应元件DR5 promoter 驱动GUS表达来表征体内生长素含量，也测定了番茄果皮中主要的天然生长素IAA的含量，发现果实发育成熟过程中，生长素与AsA含量呈负相关。随后用不同浓度的IAA处理，发现IAA抑制了番茄中AsA的积累（图.1）。通过分析IAA处理下的番茄果皮中的基因表达数据，作者发现ARF(auxin response factors )家族基因上调表达，其中SIARF4诱导表达最强烈，其表达模式与生长素浓度变化模式一致，但与AsA的变化模式相反，表明SIARF4可能在果实发育与成熟过程中参与AsA的生物合成。随后作者对SIARF4过表达和敲除株系进行分析(图.1)，发现生长素诱导的AsA积累抑制确实是由SIARF4介导的。

进一步分析已有RNA-seq数据，作者发现SIARF4下调表达的株系中AsA代谢途径受到影响，其中SIMYB11上调表达，为了证实SIMYB11在AsA代谢途径中的作用，作者在SIARF4过表达与敲除株系中检测了的SIMYB11表达模式。发现SIMYB11的表达模式与SIARF4相反，当用IAA处理SIARF4过表达株系时，SIMYB11的表达水平显著降低，表明SIMYB11表达受SIARF4负调节，并且IAA介导的SIMYB11表达抑制由介导。随后作者利用Pull Down、EMSA、CHIP-seq和萤火素酶活性检测等实验证明了SIARF4可以与SIMYB11启动子结合，表明SIARF4直接靶向SIMYB11启动子并抑制其转录（图.2）。

进一步发现SIMYB11-RNAi株系中AsA含量也显著降低，IAA处理时SIMYB11-RNAi株系中的AsA含量不再降低。表明SIMYB11正向调节AsA的积累，并且IAA诱导的AsA抑制可能是由番茄中的SIMYB11介导的。于是作者检测了SIMYB11-RNAi株系中AsA合成相关基因的表达，发现3个主要AsA合成相关基因（GPP, GLDH, DHAR）均下调表达，Pull Down与EMSA实验均证实了SIMYB11可以与他们启动子区域的MYB结合位点特异性的互作（图.3）。表明SIMYB11直接靶向GPP, GLDH和DHAR启动子并促进它们的转录。

与IAA不同的是，ABA处理增加了AsA含量，单独干旱处理与PEG6000(模拟干旱)会增加番茄中ABA的含量并增加AsA含量，但干旱与ABA合成抑制剂（fluridone）共处理则降低了ABA含量，AsA含量也降低，表明干旱会增加ABA合成，并增加AsA积累。为了揭示干旱与ABA以调控AsA积累的机制，作者通过预测并结合分析了RT-qPCR数据，发现SIMAPK8受到ABA处理与干旱胁迫诱导。并通过酵母双杂，萤火素酶和CO-IP实验证明了SIMAPK8与SIMYB11和SIARF4互作。由于MAKP家族通常是以磷酸化传递信号，作者通过序列分析发现SIARF4在317和355位含有丝氨酸，而SIMYB11在167位含有苏氨酸，于是进行体外磷酸化实验，发现SIMAPK8可以在体外磷酸化SIMYB11和SIARF4，并利用磷酸化失活突变确定了上述磷酸化位点可以被SIMAPK8磷酸化（图.4）。体内磷酸化实验也证实了这一点，再次利用萤火素酶报告基因，作者发现SIMAPK8磷酸化SIARF4并抑制其活性，而磷酸化SIMYB11则增强其转录活性。

为了进一步验证在干旱胁迫下对AsA的影响，作者获得了RNAi-MAPK8，分析发现RNAi-MAPK8植株中的总AsA含量与ABA含量均降低了，即使外源施加ABA也不能增加AsA含量，表明SIMAPK8参与了ABA诱导的番茄AsA合成，且SIMAPK8下调也降低了植物对干旱的耐受性。

 ACKNOWLEDGEMENTS 重庆大学重庆大学生命科学学院邓伟教授为论文通讯作者，博士研究生许欣为论文第一作者，浙江大学罗自身教授也参与了部分研究。该工作得到了国家自然科学基金（32172596）、重庆市科技创新与应用发展项目（cstc2019jscx-gksbX0115）、重庆市研究生科研创新基金（CYB22048）、中央高校基础研究基金（2021CDJZYJH-002），重庆市研究生科研创新项目（CYS21038）的资助。

原文链接：

https://academic.oup.com/plcell/advance-article/doi/10.1093/plcell/koac262/6674516

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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