《自然》：李晓淳研究组揭示PORCN识别底物的分子基础

2022年7月13日，美国德克萨斯大学西南医学中心的李晓淳研究组在Nature上发表文章，题为“Mechanisms and inhibition of Porcupine-mediated Wnt acylation”，对PORCN识别底物的分子基础和临床一期药物LGK974的抑制原理进行了回答。

李晓淳实验室博士研究生刘阳和博士后齐晓峰为论文共同第一作者，西南医学中心药学系的王博远教授对此项工作亦做出重要贡献。

Wnt信号通路在机体细胞的生长、发育以及代谢平衡中发挥着重要作用，同时在结肠癌，乳腺癌，胰腺癌等细胞中也显著增高。Wnt信号依赖于Wnt蛋白上Hairpin2的棕榈油酰化（Palmitoleoylation）。该修饰由内质网膜蛋白Porcupine (PORCN)介导。人体中有19种不同Wnt蛋白且均可由PORCN催化修饰，与此相反，PORCN只使用棕榈油酰辅酶A （Palmitoleoyl-CoA）作为底物。因PORCN对Wnt信号通路的高度专一性，PORCN成为了Wnt相关癌症的重要靶点之一，有多种抑制剂应用于治疗癌症的临床试验中。尽管此前有多篇生化文章分析PORCN的功能，但是对于其催化Wnt 棕榈油酰化的分子机制并不清楚，对Wnt和棕榈油酰辅酶A两种底物截然相反的选择性也未有明确的解释。

由于分子尺寸极小（<50kDa）以及缺少显著的膜外特征，PORCN的结构解析一直难以实现。通过一年多的努力，作者们最终筛选到一个识别结构的单克隆抗体。通过单克隆抗体的辅助，最终解析了四套不同的高分辨率冷冻电镜结构。

1）PORCN与底物棕榈油酰辅酶A（Palmitoleoyl-CoA）的复合物结构

2）PORCN与底物Wnt3A-Hairpin2的复合物结构

3）PORCN与产物棕榈油酰化Wnt3A-Hairpin2的复合物结构

4）PORCN与抑制剂LGK974的结构

PORCN与Palmitoleoyl-CoA的结构显示Palmitoleoyl-CoA位于蛋白的细胞质一侧。Palmitoleoyl-CoA的脂肪酰基呈现出一个特殊的蜷缩状态，并且紧密的折叠在一个狭小的空腔中。Palmitoleoyl-CoA的脂肪酰基在C9位置上具有一个不饱和双键，该双键使得脂肪酰基产生了90度的折叠。同时，PORCN上的色氨酸300（Trp300）稳定了折叠的脂肪酰基，并且通过空间进一步限制了允许的脂肪酰基的长度。因此，PORCN呈现出对底物乙酰辅酶A的高度选择性 – 既需要特殊长度的脂肪酰基，又需要合适位置的不饱和双键。相比之下，PORCN与LGK974的结构阐明了LGK974的作用方式：与palmitoleoyl-CoA的脂肪酰基竞争。LGK974整体呈现“L”型，并且LGK974的羰基氧与PORCN的丝氨酸332（Ser332）相结合。值得注意的是，许多PORCN抑制剂都具有相同的“L”型和相同的羰基氧基团，这一点揭示了PORCN抑制剂设计思路。

作者们合成了Wnt3A蛋白的Hairpin2部分。在冷冻电镜下Hairpin2呈现出符合预期的在19种Wnt中广泛保守的双二硫键折叠模式，并且完美嵌入在PORCN内质网侧的口袋。PORCN上的Wnt结合口袋呈现了高度的跨物种保守性，而hairpin2结合PORCN的残基在不同种类的Wnt也呈现出高度的保守性，这一点解释了为何单一的PORCN可以催化多达19种不同的Wnt蛋白。在解析反应产物的结构时，作者使用了人工合成的产物类似物捕捉到了反应结束后乙酰化产物的瞬时状态。该复合物结构显示出棕榈油酰化Wnt3A-Hairpin2的脂肪酰基也具有和Palmitoleoyl-CoA的脂肪酰基类似的蜷缩状态，进一步证明了PORCN对于Palmitoleoyl-CoA的高度偏好性。

综上所述，该研究揭示了PORCN催化Wnt乙酰化的反应机理 – Palmitoleoyl-CoA的硫羟键和Wnt修饰位点丝氨酸侧链上的羟基在空间上接近催化中心。PORCN催化中心的组氨酸活化了Wnt丝氨酸侧链上的羟基并攻击Palmitoleoyl-CoA的硫羟键，使得脂肪酰基加成到Wnt 丝氨酸侧链上。反应结束后产物从内质网两侧离开。同时，该研究还显示了临床一期抗癌药物LGK974的抑制原理，并提出了一种普遍的PORCN抑制剂的作用模式，为后续药物开发奠定了基础。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41586-022-04952-2

转自：“小柯生命”微信公众号

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