《分子细胞》：可爱龙实验室研发出高效快速的核酸分子诊断工具“HASTE”

北京时间2022年7月13日晚23时，美国康奈尔大学可爱龙实验室在《分子细胞》（Molecular Cell）杂志发表基于type I-A系统的新机制解析和新应用开发的研究成果。

三国有云“天下大勢，分久必合，合久必分”。自然科学亦如是。

CRISPR-Cas系统是原核生物一种抵御外来入侵核酸的免疫系统，已被广泛用于真核细胞的基因组编辑。目前基于CRISPR-Cas的基因编辑技术已广泛应用于遗传育种、新药开发、疾病治疗、动物模型构建、转录调控以及分子诊断等各领域。被誉为在后基因组时代开创了遗传疾病精准治疗的新时代。

CRISPR-Cas系统可以按照效应物是多亚基或单亚基分为Class I和Class II（一型和二型）。单亚基效应物的Class II家族包括大家常用的Cas9, Cas12, Cas13等，因其简单、高效、普适性的特性，其应用早已风靡全世界实验室。如果从分布比例上看，多亚基类型的Class I家族才是CRISPR-Cas系统的“名门望族”，其占比超过75%，对比Cas9，Cas12，Cas13总和也不过10%左右，可谓呈“辗轧之势”。然而Class I家族CRISPR-Cas系统，因为多亚基特性，其样品的获取，操作的编辑性，功能、机制的研究等都显得相对难度更大，因此该家族的研究和应用一直滞后很多。

不过近些年，Class I家族引起低脱靶，低毒性，功能更丰富多彩的特性，正逐渐展现出特有的魅力(1-7)。不过Class I家族庞大，成员众多，同时每一亚类可能又展现不同的性质，因此对这一庞大家族的了解也不透彻。

对于Type I系统，大家普遍认知的工作机制是Cascade首先靶向目标DNA，形成full R-loop之后,再招募Cas3完成对靶标DNA的切割和水解。简而言之就是：“分—合—分”机制。然而可爱龙实验室胡纯一博士等人发现Type I-A 系统一个显著不同于type I其他系统的性质：Cas3与Cascade是形成一种内在的复合物，而不依赖于目标DNA靶向与否，简言之就是“合-合-合”。（如下图所示）

分分合合与否，固然鲜明。然而CRISPR系统最重要的一项性质就是：该系统如何去避免脱靶效应，从而降低非特异性的切割？其他的Type I系统利用Cas3的招募与否来规避脱靶效应（非特异性的靶向不能招募Cas3）。因此，Cas3一直结合在Cascade上的type I-A系统又是如何去规避这一难点？

胡纯一博士联合瑞士洛桑大学/瑞士联邦理工学院Henning Stahlberg实验室倪冬春博士等人，使用冷冻电镜全面解析了type I-A 系统九种状态下的全景工作机制。这些捕获的工作状态桥段，确切的表面，Cas3通过与Cas8的互作，从而成为Cascade的内在一部分，并且Cas3通过稳定Cas8的N端构象，极大的促进了PAM识别和DNA靶向，该结果表面Cas3的内在性是具有积极和重要作用的。重要的是，他们发现，type I-A Cascade结合DNA形成完全互补配对的full R-loop结构之后，通过层层构象变化，最终传递给Cas3产生一个巨大的构象改变，暴露核酸酶活性中心，从而开始切割靶向DNA。而部分结合（非特异性结合）靶标形成的partial R-loop结构不能产生这种刺激，Cas3核酸酶依然保持抑制状态，从而避免脱靶切割 （如下图）。

众云“合（和）为贵”，那么这套type I-A系统独特的吸引力在哪里？胡纯一博士等人发现，type I-A 内在式的Cascade-Cas3复合物在不结合目标DNA时，完全没有任何核酸酶性质，而当有正确的靶标出现，激活Cas3活性之后，会产生一个附属活性，从而可以对FQ-ssDNA探针（荧光-淬灭-单链DNA探针）进行切割，产生荧光，因此可以通过荧光的强弱即可判断是否有目标DNA。团队以此原理，开发了一套高效快速的核酸分子诊断工具，并命名为“HASTE” (heat-activated streamlined nucleic acid detection platform)。该系统可以在15分钟之内，对单分子量级的DNA完成检测，效果显著，有着与传统PCR一样可靠的精度，却极大缩短了时间和成本（下图）。

有意思的是，该项工作还发现，这个I-A系统Cas3的解旋酶活性严格依赖温度，温度越高，活性越强。因此可爱龙团队利用42度温度刺激，可以开发一套温控基因敲除工具，效率超过90%。因此，在未来，可以利用该性质，未来可以在病灶通过局部的温度刺激来调控该工具的基因编辑效率，从而最大限度地降低基因编辑工具带来的脱靶效应。

结语：分分合合的性质无关好坏，最后都能抵抗外来侵略（细菌抵抗噬菌体）完成自己种族的延续就是好的系统，type I CRISPR系统如是，人间亦如是。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.06.007

转自：“小柯生命”微信公众号

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