PBJ | 利用BSMV病毒的sgRNA递送系统在小麦Q基因启动子上实现多靶标编辑

使用CRISPR-Cas基因编辑技术来改良作物主要依赖于对参与调控关键性状的基因的功能的理解。基于Cas9和Cas12a的CRISPR技术已成功应用于小麦基因组中的单个基因和多个基因的编辑，但常规基因编辑需要进行大规模转化和后代筛选。此外，为小麦和许多其他作物开发的遗传转化方案仅限于少数具有高再生能力的品种。为此研究人员采用再生相关转录因子（WUS,BBM,GRF-GIF等）来提高再生的效率，但组织培养依旧是费时费力的工作，这限制了基因编辑技术的发展。

最近，基于病毒的sgRNA递送系统在几种主要作物包括小麦中进行了测试。与传统农杆菌转化相比，病毒递送系统依赖于病毒在植物细胞中传播的自然能力，同时可以跳过植物转化和再生

2022年8月16日，美国堪萨斯州立大学植物病理学系的Eduard Akhunov团队在《Plant Biotechnology Journal 》上发表了题为”Multiplexed promoter and gene editing in wheat using a virus-based guide RNA delivery system”的研究论文，作者主要研究了基于BSMV病毒的sgRNA递送系统在诱导多个靶向突变和片段缺失的能力。通过将多种不同的BSMV-gRNA混合，作者在一个控制小麦驯化性状的转录因子的启动子中创建了一系列的缺失。

首先，作者研究了植株中Cas9的表达量高低对病毒递送系统编辑效率的影响，在Cas9低表达量的系7438中，编辑效率仅为0.43%，而在Cas9高表达量的系C413中，编辑效率高达98%。这一结果表明，通过BSMV传递sgRNAs进行有效的基因组编辑需要植株中的Cas9处于高表达量。

以往的研究证明，利用可移动的RNA促进sgRNAs进入顶端分生组织细胞，可以提高基因编辑效率。但是先前在不同的植物物种中关于融合移动因子对基因组编辑效率的研究产生了矛盾的结果。作者在小麦中对目前常见的移动因子（AtFT,Vrn3,tRNAmet, tRNAile）的效果进行了重新评估。结果显示，没有融合移动因子的对照BSMV-GW2T2，其接种叶片的编辑效率达到了77%，而融合了AtFT,Vrn3,tRNAmet, tRNAile移动因子的实验组，其接种叶片的编辑效率分别为（29%，33%，76%，6%），对比对照组均有所下降。同时通过对M1代进行基因型鉴定，作者发现M1代的可遗传率与M0代的接种叶片的编辑效率有关，其中对照组BSMV-GW2T2的M1代有88%检测到了目标基因的可遗传编辑，而且其中有61%的后代是同时编辑了目的基因的六个拷贝。而融合了tRNAmet的实验组则只有48%的后代检测到了目的基因的可遗传编辑。在融合了AtFT的实验组中，只有19%的后代检测到了目的基因的可遗传编辑。

接下来，作者研究利用BSMV病毒递送系统进行多基因同时编辑，作者同时递送多个sgRNA同时编辑TaGW2, TaUPL3 和TaGW7基因，与递送单个sgRNA相比，混合递送时目标基因TaGW2，TaGW7的接种叶片编辑效率有所下降，而TaUPL3 在两种递送方式下则是有着相同的接种叶片编辑效率。在后代M1中检测到GW2、UPL31和GW7靶位有编辑的植株比例分别从96%下降到2.3%，从27%下降到19%，从51%下降到21%。只有5.7%的M1植株在两个靶点有编辑，没有三个靶点都被编辑的M1植株。这些结果表明，随着混合递送sgRNA数量的增加，单个靶点的编辑效率和多重基因编辑效率都会降低。

接下来，作者利用混合递送系统对小麦5A染色体的Q基因等位基因的启动子进行多重基因编辑，该基因控制小麦的一系列驯化性状例如穗形态、自由脱粒习惯、轴的脆性，对其启动子区域进行编辑，可能会去除对基因表达水平有积极或消极影响的调控元件，可能会影响由Q基因控制的不同生物通路。作者设计了5个靶位点：pQT17、pQT18、pQT23、pQT25和pQT26，其接种叶编辑效率分别为37%、28%、25%、27%和5%。每个靶点在M1植株中有编辑的比例分别为15%、11%、6%、6%和0%。同时约有32%的后代M1植株有至少一个靶位点被编辑。没有M1植株有三个或三个以上的靶点被编辑。共有5%的M1植株在两个靶点有编辑，比M1植株出现单个靶点编辑的比例（27%）低了近5倍。在M0和M1的pQT17、pQT18靶位点均检测到了片段的缺失，但是表达量检测后发现与野生型并无区别，作者认为他们虽然成功编辑了Q基因的启动子，但是他们可能并未将启动子上Q基因的调控区域成功编辑。

最后，作者采用回交育种手段，将Cas9高表达量系中的Cas9导入春小麦和冬小麦的栽培种中，随后作者利用BSMV病毒递送系统分别递送sgRNA成功编辑TaGW7和Q基因，并在后代M1植株中检测到了可遗传的编辑。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.13910

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！