Nature Plants |马普所高赫博士揭示PIF4协同CDF2调控拟南芥细胞伸长

细胞对环境及发育信号的响应依赖于转录因子对特定基因的调控。研究表明，不同的转录因子能够通过形成复合物特异识别并调控下游基因，进而整合不同的信号通路，然而不同的转录因子具有不同的DNA结合结构域，目前对它们之间协同工作的分子机制仍知之甚少。PIF4 (PHYTOCHROME INTERACTING 4) 是bHLH转录因子，它调控拟南芥对光及高温的响应。CDF2 (CYCLING DOF FACTOR 2) 是植物特有的DOF转录因子，它参与植物体内多种生物学过程。有趣的是，DOF属于锌指蛋白，在动物中，锌指蛋白通常含有多个锌指结构域以增强其对DNA的结合。然而，DOF转录因子只含有一个锌指结构域，它识别并结合的基序AAAG或T/AAAG在植物基因组内普遍存在，那么它是如何识别并且被招募至特异基因的调控区呢？之前研究表明PIF4和CDF2都能够调节拟南芥下胚轴生长，二者在此功能上是否有协作？本文通过分析比较不同突变体pif4、cdfq（四突）以及pif4 cdfq (五突)的下胚轴表型得出二者位于同一遗传途径共同调控拟南芥下胚轴伸长。进一步通过一系列体内、外多组学及生化等分析阐述PIF4能够与CDF2形成复合物，并且能改变DNA的构象以增强CDF2对DNA的结合。

2022年8月15日，德国马克思普朗克植物育种研究所George Coupland研究组在Nature Plants发表了题为“PIF4 enhances DNA binding to CDF2 to co-regulate target gene expression and promote Arabidopsis hypocotyl cell elongation”的研究论文。该研究通过一系列的体内、外实验证明PIF4能够与CDF2直接互作，二者以复合物的形式结合到下游基因YUCCA8启动子，促进拟南芥下胚轴的伸长。该文阐述了两种不同转录因子协同调控下游基因的分子机制。

主要研究结果

1、PIF4和CDF2作用于同一条遗传途径调控拟南芥下胚轴细胞伸长

作者通过分析比较不同突变体pif4、cdfq（四突）以及pif4 cdfq的下胚轴细胞数量及长度发现PIF4和CDF2主要通过影响细胞的长度而非细胞数量调控拟南芥下胚轴伸长（图1）。

2、PIF4和CDF2在表皮细胞中表达且直接互作

CDF2::CDF2-Venus; cdf2-1及PIF4::mScarlet-I-PIF4; pif4-101转基因材料显示CDF2和PIF4均在表皮细胞的细胞核中表达。体内、外的Co-Immunoprecipitation (Co-IP) 实验表明CDF2和PIF4直接互作。

3、PIF4和CDF2可结合并调控相同的target

作者通过ChIP-seq在野生型和pif4突变体背景中鉴定CDF2的结合位点并且与之前鉴定到的PIF4结合位点比较，发现PIF4和CDF2有很多共同的target表明PIF4和CDF2功能是相关的。并且，pif4和cdfs突变体的RNA-seq显示有些target受PIF4和CDF2的共同调控。此外，在pif4突变体背景下CDF2对许多基因的结合能力下降，表明PIF4可以增强CDF2对DNA的结合能力。结合ChIP-seq和RNA-seq数据，作者鉴定到了一系列基因，它们受PIF4和CDF2的共同调节、且PIF4能增强CDF2对其结合、并且其表达量在pif4和cdfs突变体中下降（图2），这其中包括生长素合成相关的酶YUCCA8。

4、PIF4增强CDF2结合YUCCA8启动子的分子机制

首先，作者分析了CDF2 Dof DNA binding domain (CDF2Dof)的结构，与经典的锌指蛋白类似，CDF2Dof包含一个α-helix及两个β-sheet (Fig. b)。为了研究CDF2Dof对DNA结合的特异性，作者通过EMSA实验阐明，在体外，CDF2Dof对基序T/AAAG（5个核苷酸）的结合能力强于AAAG（4个核苷酸）。其次，作者也分析了PIF4的DNA结合domain (PIF4bHLH)的结构，模拟结果显示PIF4bHLH以二聚的形式结合DNA (G-box) (Fig. c)。为了验证该模型，作者在体外纯化PIF4bHLH蛋白，分子筛数据表明，PIF4 bHLH在体外能形成稳定的四聚结构 (Fig.d)。当四聚体的互作界面被打破后，PIF4只能形成二聚体，随之对DNA的结合能力明显减弱。因此，PIF4 bHLH的四聚形式增强了其对DNA的结合能力。最后，作者通过EMSA比较CDF2Dof和PIF4 bHLH不同突变蛋白组合对不同突变的DNA探针的结合情况。结果表明，PIF4 bHLH结合G-box是二者产生super shift的关键因素。并且，即使将CDF2Dof的结合基序AAAG或T/AAAAG突变，PIF4 bHLH依然能增强CDF2Dof对DNA的结合能力。因此，四聚或潜在的寡聚形式的PIF4可能通过改变DNA构象从而增强CDF2对DNA结合的强度及特异性。

展望

本研究表明PIF4能够增强CDF2对DNA结合的特异性及强度，但是CDF2是否能影响PIF对DNA的结合目前还不清楚。此外，本文在体外实验中仅研究了这两个蛋白的DNA结合结构域对下游基因转录调节的分子机制，因此这两个蛋白的其他结构域是否也参与转录调节还未知，对全长蛋白的研究有望回答这个问题。另外，若能获取CDF2Dof-PIF4bHLH-DNA的结构信息也会加强我们对该复合物成员间协同工作机制的理解。总而言之，本文结合体内基因组范围内的DNA结合分析、基因表达分析和体外蛋白-DNA结合分析阐述了两种不同转录因子协同调控下游基因的分子机制，为研究其它转录子协作模式提供了思路。

Acknowledgements

德国马克思普朗克植物育种研究所博士后高赫(https://orcid.org/0000-0001-8001-5699)为本文第一作者，现任所长George Coupland(https://orcid.org/0000-0001-6988-4172)教授为通讯作者。科隆大学博士后宋文(https://orcid.org/0000-0002-9498-2409) ，科隆大学教授、洪堡学者柴继杰(https://orcid.org/0000-0001-7591-3873)参与了本课题蛋白结构模型预测和体外生化实验的设计与讨论。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41477-022-01213-y

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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