JIPB | ​植物转基因成分CRISPR/Cas12a高效快检技术的开发

随着全球转基因作物种植面积的不断增加，各国对转基因的监管日趋严格，因此对转基因成分的准确检测显得尤为重要(ISAAA Brief 55-2019)。目前对转基因作物的检测按照原理可以分为针对外源蛋白质，以及针对外源DNA的两种鉴定方法。外源DNA鉴定主要是利用PCR等扩增技术对特定核酸进行指数扩增检测；外源蛋白质的测定主要是采用免疫学检测法通过抗原抗体特异反应来检测具有抗原性的外源蛋白质(Fraiture et al., 2015)。目前这两种方法中针对外源DNA的鉴定需要复杂的仪器设备；而针对酶联免疫的检测，受制于抗体的产生，一些转基因成分，特别是小分子成分比如启动子和终止子等元件很难建立检测反应。为了有效支撑转基因相关产业的发展和管理，适应监管需求，需要开发建立一种快速，便捷，高灵敏度的田间转基因检测方法。

JIPB近日在线发表了山东舜丰生物科技有限公司和中国热带农业科学院三亚研究院题为“Cas12a-Based On-Site, Rapid Detection of Genetically Modified Crops” 的研究论文（https://doi.org/10.1111/jipb.13‍3‍42）。该研究基于环介导的等温扩增（LAMP）和LbCas12a的反式切割活性，实现了对pCaMV35S启动子，NOS终止子，卡那霉素抗性基因（NPTII）及潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）等难于建立酶联免疫检测的植物转基因成分的快速检测。

该研究开发了适用于大豆、玉米、水稻、番木瓜等的核酸粗提方法，取叶片简单研磨30 s后，无需纯化即可用于LAMP扩增，通过筛选不同转基因元件的LAMP引物，转基因元件成分最低检出限为0.01%，高于转基因成分PCR检测标准极限值0.1%。同时，该研究系统的优化了LbCas12a的缓冲体系，开发了一种高效的SF缓冲液，可以在5 min内达到最大的反式切割活性。此外，研究者还找到了LbCas12a和MAD7特异切割的双链荧光报告分子，这种双链荧光报告分子的荧光强度是普通单链荧光报告分子的3.5倍。为了进一步的减少检测成本，研究者开发了10个样本的混样检测体系和35S启动子和潮霉素基因的双重检测能力。为了减少核酸污染及提高整个装置的便携性，研究者开发了一款3D打印装置将等温扩增，CRISPR核酸检测和试纸条显色三者结合到一起。整个装置从取样到出检测结果只需要40 min，可通过试纸条或蓝光灯来读取结果，通过小规模随机双盲测试，该研究开发的实验装置与PCR的结果100%一致。因此，该研究为田间转基因快检提供了高效，便携，高灵敏度，低成本的检测方式。

舜丰生物科技有限公司段志强博士，中国热带农业科学院三亚研究院杨小亮助理研究员为该文的共同第一作者，舜丰生物科技有限公司高级工程师李峰，中国科学院分子植物科学卓越创新中心郎曌博研究员，中国热带农业科学院三亚研究院赵辉研究员为通讯作者。段志强博士团队一直致力于CRISPR-Cas在核酸检测方面的应用，新型基因编辑工具酶的挖掘及优化，目前开发了新冠，手足口病毒和动植物病原菌检测试剂盒。该研究得到了海南省重大科技项目基金-南繁育种区生物安全防控和海南省院士创新平台的支持。

参考文献：

1. International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA). (2019). ISAAA Brief 55–2019: Executive summary: Biotech crops drive socio-economic development and sustainable environment in the new frontier.

2. Fraiture, M.A., Herman, P., Taverniers, I., De Loose, M., Deforce, D., and Roosens, N.H. (2015). Current and new approaches in GMO detection: challenges and solutions. Biomed Res Int 2015: 392872.

转自：植物生物技术Pbj

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