Jennifer Doudna最新研究：基于Cas13，可用唾液快速检测新冠

来源丨丁香学术

新冠疫情下，常态化核酸检测已经成为日常生活的新常态。快速、即时的核酸检测是遏制新冠疫情传播的强大武器。RT-PCR 是当下新冠检测的「金标准」 ，但需要大量劳动力和设备基础设施进行样本采集、核酸提取、热循环和数据分析，整体检测流程较长。因此，开发一种无需复杂仪器、快速诊断的检测技术至关重要。

2022年8月11日，诺奖得主、加州大学伯克利分校 Jennifer Doudna，以及 David Savage 和 Patrick Hsu 团队，在 Nature 子刊 Nature Biomedical Engineering 上发表了题为：Rapid detection of SARS-CoV-2 RNA in saliva via Cas13 的研究论文。

该研究报告了一种高敏感性和高特异性的快速检测新冠病毒的方法——DISCoVER，无需提取 RNA，就可以检测出唾液中的 SARS-CoV-2。

首先，研究者试图比较 Cas13 和 Cas12 酶的核酸检测特性，评估了 Leptotrichia buccalis Cas13a（LbuCas13a）和 Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cas12a（LbCas12a）的报告酶切割活性，并在其相应的合成活化剂分子稀释系列中，使用匹配的引导 RNA 间隔序列。结果显示 LbuCas13a 在低活化剂浓度下的检测速度明显快于 LbCas12a。

为了达到更高的灵敏度，研究者选择了环介导等温扩增技术（LAMP）作为一种经济高效的核酸扩增方法。LAMP 使用逆转录酶、链置换 DNA 聚合酶和三组引物，将病毒 RNA 转化为 DNA 底物。

由于 Cas13 靶向单链 RNA，而 LAMP 扩增 DNA 底物，研究者采用了 LAMP 产物的转录来实现底物的兼容性。将 T7 RNA 聚合酶启动子序列整合到 LAMP 引物序列，用于后续的转录和 Cas13 检测，研究者将此称为 rLAMP。经测试，T7 启动子在 rLAMP 扩增子中正确掺入并发挥作用。

为了确认 DISCoVER 检测方法的可复制性，研究者在 8 个 mBIP rLAMP 反应重复中测试了 Cas13 检测，其中 RNA 在 20 μl 反应体系中的浓度为 100 拷贝/μl。所进行的八次重复中阳性样本信号均是阴性对照的 25 倍以上，保持很好的稳定性。

接下来，研究者试图确定 DISCoVER 对唾液样本的分析灵敏度和特异性。对一系列病毒浓度进行了 20 次 DISCoVER 重复检测后，确定了唾液中病毒检测的最低浓度为 40 拷贝/μl。为了测定 DISCoVER 的特异性，对来自 30 个 SARS-CoV-2 阴性的不同个体的唾液样本进行了测试，没有出现任何假阳性信号。

接下来，研究者中使用 DISCoVER 验证了从患者呼吸道拭子样本中提取的总 RNA。结果显示，DISCoVER 对提取的 RNA 的敏感性为 93.9%，特异性为 100%。此外，研究者观察到 PPV 为 100%，NPV 为 93.75%。

最后，研究者开发了一种紧凑型便携式微流体设备，可在即时护理应用的环境中进行检测。该化学反应适用于在重力驱动的微流控盒上运行，具有温度控制的反应和检测室。该装置包含用于控制流体流动的排气泵、用于 rLAMP 室的电阻加热器和用于 Cas13 室冷却和加热的热电冷却器/加热器（TEC）。测定荧光检测由紧凑型定制检测器进行，用于实时样品读数。

研究者对 DISCoVER 设备进行了实验验证。重新测试了三个阴性和三个阳性呼吸道临床样本。在所有三个阳性样本中均正确检测到了 SARS-CoV-2，并且在所有三个阴性样本中仅检测到 RNase P 信号。然后，研究者对 10 个经 RT-qPCR 检测为 COVID-19 阳性的现场收集的临床唾液样本和 3 个阴性唾液样本进行了检测，进一步验证了该设备的稳健性和可重复性。

本研究开发了一种新的 SARS-CoV-2 检测方法——DISCoVER 检测，建立了不需要提取 RNA 的检测流程，可以对唾液中的 SARS-CoV-2 进行检测。DISCoVER 检测结合了 30 分钟的 rLAMP 步骤，然后是 T7 转录和基于 Cas13 的检测，灵敏度和特异性极高，实现了快速检测。敏感的核酸扩增与 CRISPR 介导的特异性和可编程性相结合，有可能为多种病原体检测提供灵活的诊断。

与咽拭子或鼻拭子样本相比，唾液样本的采集更具舒适性。同时，唾液采集可能不需要医务人员进行，因此更能节约样品采集所需的人力，也使得该研究成果更具有应用推广的价值。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41551-022-00917-y

转自：生物世界

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