Nature子刊 | 复旦大学王勇翔等团队发现33个残基肽标签可提高大肠杆菌产生的单链抗体片段的溶解度和稳定性

单链可变片段(scFvs)由通过接头连接的抗体重链和轻链的可变结构域组成，与其亲本抗体共享抗原结合能力。由于固有的低溶解度和稳定性，只有两种大肠杆菌生产的scFv已被批准用于治疗。

2022年8月8日，复旦大学王勇翔及中国科学院上海药物研究所陈示洁在Nature Communications发表题为“A 33-residue peptide tag increases solubility and stability of Escherichia coli produced single-chain antibody fragments”的研究论文，该研究报告了一种名为P17标签的33个残基肽，它将大肠杆菌SHuffle菌株中产生的多个scFv的溶解度提高了11.6倍。

亲水序列，尤其是带电残基，而不是预测的P17标签的α-螺旋二级结构，有助于提高溶解度。值得注意的是，P17标签提高scFv的热稳定性与域内二硫键一样有效。此外，靶向乙型肝炎病毒表面蛋白的P17标记的scFv显示出比未标记版本高两倍以上的抗原结合亲和力和病毒中和活性。这些数据强烈表明P17标签的I型分子内伴侣样活性。因此，P17标签有利于scFv的研究、生产和应用。

作为抗体片段的一种形式，scFv被应用于基础研究、诊断和治疗领域。在不同的表达宿主中，大肠杆菌以低成本提供快速生长。然而，scFv通常以不溶性聚集体的形式表达，因为具有还原性细胞质环境的常见大肠杆菌菌株无法支持分子内二硫键的形成。提高scFv在大肠杆菌中溶解度的策略包括在氧化周质空间中表达、降低培养温度、伴侣蛋白的共表达，使用工程改造的大肠杆菌变体提供更具氧化性的细胞质，并将溶解度促进标签融合到scFv 。该研究将33-aaP17肽标签和进一步缩短的变体定性为小尺寸融合标签，显著增加了scFv在大肠杆菌SHuffle细胞中的溶解度、可溶性产量和稳定性。

P17标签对多种scFv的溶解度增强作用，与其他蛋白质标签类似，P17标签对scFv的溶解度增强取决于表达宿主和特定scFv 的特性。研究数据还表明，P17标签有助于采用稳定折叠的scFv构象，但不需要维持它。出于治疗和诊断目的，scFv和双抗体必须在注射后数小时至数天内保持抗原结合活性而不会在37°C下聚集，这需要高内在稳定性。P17标签不仅提高了在大肠杆菌SHuffle菌株中的表达溶解度，而且提高了G12-scFv的热稳定性和抗原结合亲和力。通过这种方式，P17标签可以有利于scFvs的长期储存稳定性，这实际上得到了P17标签scFvs冷冻保存1.5年后观察到的更少的不溶性聚集体的支持。因此，据研究人员了解，P17标签是第一个报道的增加scFv热稳定性的肽标签。

P17标记与未标记的G12-scFv-HA相比具有更高的热稳定性以及更强的抗原亲和力和病毒中和活性，这表明P17标记通过分子内伴侣样活性促进了scFv的正确折叠。目前定义了两种类型的分子内伴侣。I型分子内伴侣通过充当折叠核或防止错误折叠和聚集在蛋白质折叠的早期阶段协助形成三级结构，而II型分子内伴侣不直接参与蛋白质折叠但在四级结构的形成中起关键作用。P17标签本身是单体的，不会改变scFv的四级构象。此外，在反式纯化后添加的过量P17肽不会增加G12-scFv的热稳定性。所有这些数据表明P17标签作为I型分子内伴侣起作用。在scFv-P17融合蛋白的折叠过程中，P17标签可能与scFv折叠中间体的疏水区域相互作用，但也通过许多极性残基与溶剂分子相互作用。这将促进蛋白质正确折叠并抑制聚集体的形成。实际上，减少带电残基的数量会削弱P17标签的溶解度增强能力，类似于非ATP水解保持酶伴侣和α-晶状体蛋白衍生的肽迷你伴侣。

除了溶解度，稳定性是scFv实际应用的另一个挑战。双结构域scFv的整体稳定性，包括VH和VL结构域的内在稳定性，以及疏水性VH-VL界面的稳定性，与互补决定区的特定序列和亚结构域（如β桶）的内在稳定性密切相关. 每个scFv单体连接两个β片层的域内二硫键对于许多scFv的内在域稳定性也至关重要，因为一个二硫键为蛋白质折叠贡献4-6kcal/mol的自由能。DTT处理后G12-scFv约3°CTm降低证实了这一点。值得注意的是，P17标签将G12-scFv的Tm提高了2.3°C，从而提高scFv的整体稳定性与域内二硫键一样有效。因此，P17标签增加的scFv稳定性最有可能也是由于I型分子内伴侣活性。因此，P17标签可以通过增加展开的能垒和稳定疏水的VH-VL界面来促进蛋白质折叠，最终减少混杂的结构域交换以将单体和二聚体寡聚成可溶或不溶的聚集体。

参考消息：https://doi.org/10.1038/s41467-022-32423-9

转自： iNature

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