PBJ | 合成生物学新进展！利用柑橘愈伤组织和烟草叶片高效合成抗癌明星药物-藏红花素！

藏红花素是有益的抗氧化剂和潜在的化学治疗剂。藏红花素由藏红花素二醛形成，藏红花素二醛通过类胡萝卜素裂解双加氧酶2L(CsCCD2L)从玉米黄质中产生，而藏红花素的另一个主要来源栀子中的GjCCD4a将不同的类胡萝卜素（包括玉米黄质）转化为细菌中的藏红花素二醛。由于难以通过化学合成获得藏红花素，以及收获和加工手工采摘的藏红花和栀子花柱头的高劳动力成本，因此非常需要新的生物技术方法来大量生产这些化合物。

近日，阿卜杜拉国王科技大学沙漠农业中心Salim Al-Babili团队在Plant Biotechnology Journal上发表了一篇题为“The Gardenia Carotenoid Cleavage Dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues”的研究论文。为了建立可持续生产藏红花素的生物技术平台，该团队研究了GjCCD4a在由农杆菌介导的多基因超转化工程改造的柑橘愈伤组织和瞬时转化的本氏烟草叶片中的酶活性，并与CsCCD2L进行了比较。证明了GjCCD4a与八氢番茄红素合酶和β-胡萝卜素羟化酶基因的共表达是在柑橘愈伤组织中异源生产藏花酸、藏红花素和长青霉素的最佳组合。研究人员建立了一个研究植物中CCD酶活性的系统，以及一个在绿色和非绿色作物组织/器官中生产藏红花素的高效生物技术平台。

通过柑橘愈伤组织中的多基因超转化和本氏烟草叶片中的瞬时表达，对GjCCD4a和 CsCCD2L进行功能比较，旨在确定有效的酶的多基因组合，用于生物技术生产藏红花素和非绿色和绿色组织/器官中的其他有价值的类胡萝卜素。结合酶法测定和工程柑橘愈伤组织的类胡萝卜素分析，研究人员提供了直接证据，证明从β胡萝卜素到C20藏红花素二醛的新途径可能通过植物中的C30β-apo-8′-胡萝卜素中间体进行，并证明GjCCD4在生成C17二醛。此外，工程化的愈伤组织系统用于确定以生物技术生产藏红花素、藏红花素和藏红花素的最佳组合，还揭示了类胡萝卜素/类胡萝卜素模式的扰动如何影响类胡萝卜素生物合成途径、代谢组和质体超微结构。更重要的是，研究人员发现GjCCD4a在工程藏红花素和其他植物组织中的其他类胡萝卜素中是CsCCD2L酶的优越替代品。

研究人员首先改造了Citrus paradisi Macf的白色愈伤组织。(WT)含有非常低水平的类胡萝卜素，质粒pK2GW7-TpCrtB赋予卡那霉素抗性并启用TpCrtB 表达，这导致了显着的橙红色转基因系PSY。类胡萝卜素分析表明，除了少量的下游叶黄素外，PSY系主要积累胡萝卜素（β-胡萝卜素和α-胡萝卜素）。PSY和BCH/PSY系的颜色和类胡萝卜素模式保持不变，即使在传代培养超过36个循环后，这表明CCD基因的功能研究所需的稳定性。定量实时PCR证实了类胡萝卜素生物合成物（即tpCrtB和OsBCH）和CCD基因在工程愈伤组织系中的成功异源表达。CCD4/PSY产生明显的淡黄色，而相应的CsCCD2L 过表达线(CCD2/PSY) 与 PSY 线相似。在黄色BCH/PSY背景中过度表达 GjCCD4a 或 CsCCD2L会产生非常淡黄色的愈伤组织。GjCCD4a 的过表达大大降低了有色胡萝卜素和叶黄素的含量，但增加了八氢番茄红素的含量。

研究人员对类胡萝卜素分析和体外测定揭示了GjCCD4a对类胡萝卜素的切割以及藏红花素二醛生物合成中的连续步骤。通过对类胡萝卜素进行了定量分析。与WT系相比，所有转基因系都含有更高水平的类胡萝卜素，这与其较高的类胡萝卜素含量一致。三个独立的CCD4/PSY 系显示出显着较高的β-环柠檬醛 (C10和β-apo-8′-胡萝卜醛(C30)含量，它们是通过β-胡萝卜素的C7′-C8′裂解双键产生的，但较低与 PSY 系相比，C9′-C10′裂解产物β-apo-10′-胡萝卜素（C27）的水平。表明GjCCD4a 还可以在植物中将β-胡萝卜素转化为藏红花素二醛。结果表明，β-apo-8'-胡萝卜素是GjCCD4a的底物，并且 GjCCD4a从β-胡萝卜素生物合成藏红花素二醛的新途径发生在两个连续的步骤中。

此外，研究人员注意到用pEAQ-GjCCD4a和PEAQCsCCD2L农杆菌浸润的叶子提取物的极性部分中肉眼可见独特的黄色色素，这在EV叶子中没有观察到。对这些黄色极性部分的UHPLC分析显示，在440 nm处有一系列在EV叶子中无法检测到的峰，包括在6.9和7.5分钟洗脱的两个峰，在439nm和462nm处显示紫外吸收最大值，以及440nm 和463 nm，与藏红花柱头和栀子果实中最丰富的两种藏红花素。PEAQ-GjCCD4a和 PEAQ-CsCCD2L农杆菌浸润叶片均主要积累藏红花素II，其次是其他藏红花素。与表达CsCCD2L的叶片相比，表达GjCCD4a 的叶片在浸入100%乙醇后表现出更强的黄色表型，而EV叶片几乎是无色的。与这一观察结果一致，表达GjCCD4a的叶片中总藏红花素（1.61 ± 0.16 mg/g DW）和藏红花素II的含量比表达CsCCD2L的高出两倍以上。

转自：植物生物技术Pbj

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