PBJ | 利用CRISPR/Cas9介导的基因敲除获得了本氏烟草fls2突变株并揭示了不同FLS2受体的识别特异性

近日，南京林业大学程强课题组在植物学领域国际知名期刊《Plant Biotechnology Journal》（IF=13.263）在线发表了题为“CRISPR/Cas9-mediated generation of fls2 mutant in Nicotiana benthamiana for investigating the flagellin recognition spectrum of diverse FLS2 receptors”的研究论文。该研究通过CRISPR/Cas9技术分别和共同敲除了本氏烟草的两个FLS2基因，发现只有NbFLS2-2有助于识别 flg22Psy（源自假单胞菌）。此外，研究人员结合瞬时表达技术和 ROS 爆发检测，在本氏烟草FLS2双突变体中快速验证了29种植物FLS2的鞭毛蛋白识别谱。

FLS2（flagellin-sensing2）是一种位于细胞表面的模式识别受体（PRR），可以识别细菌鞭毛蛋白N端的保守多肽（flg22），产生模式触发的免疫（PTI）。异源四倍体本氏烟草中有两个高度相似的FLS2基因，研究人员设计了三种sgRNAs分别或同时靶向NbFLS2-1和NbFLS2-2，获得了单突变和双突变植株。为了验证NbFLS2s的功能缺失，研究人员针对野生型和突变株系进行了3个典型的细菌鞭毛蛋白响应实验：ROS爆发、MAPK信号途径的激活和生长抑制。另外，研究人员还在双突植株中进行了互补实验，分别瞬时表达两个NbFLS2基因后进行ROS爆发的检测，以上结果均支持本氏烟草中只有NbFLS2-2识别flg22Psy，而NbFLS2-1无识别功能。

大多数高等植物中都存在FLS2同源基因，但它们编码蛋白的识别特异性存在差异。在本氏烟草叶片中瞬时表达FLS2后进行鞭毛蛋白诱导的ROS爆发测定可以初步验证FLS2的功能，但烟草本身内源的FLS2限制了该方法的应用。而该研究中获得的NbFLS2双突变体可以克服这一困难。研究人员从29种植物中克隆了FLS2同源基因的gDNA序列，并在双突植株中瞬时表达，进而使用三种典型的flg22（或flg15）进行处理，测定ROS爆发，揭示了不同植物FLS2的鞭毛蛋白识别谱。例如，银杏、长寿花和荷花的FLS2无法识别flg22Psy，不同杨属植物FLS2对flg15Eco（源自大肠杆菌）的识别存在差异，另外，栓皮栎FLS2和络石FLS2对flg22Agro（源自农杆菌）高度敏感。

该研究建立了的方法可以快速验证不同植物FLS2的鞭毛蛋白识别谱，结合目前丰富的植物基因组信息，将有助于筛选具有广谱抗性或针对特定病原体抗性的FLS2，对植物抗病育种有重要意义。

南京林业大学林学院程强课题组在读硕士研究生邬玲为该论文的第一作者，程强副教授为通讯作者，南京林业大学为第一单位，该研究得到了国家自然科学基金项目（31870658）的资助。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13898

转自：植物生物技术Pbj

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