NC | 去黄化诱导蛋白1 (DEIP1)介导拟南芥细胞色素b6f(Cytb6f)复合物的组装

植物通过光合作用将光能转化为化学能需要类囊体膜中蛋白质复合物的协同作用。类囊体蛋白复合物是由质体基因组和核基因组共同参与编码的蛋白质亚基组成的大分子复合物，参与了光合作用过程中光合电子的转移。此外，它们还结合大量色素（叶绿素、类胡萝卜素）、脂质和氧化还原活性辅助因子，如血红素和铁硫簇。辅助蛋白因子在类囊体蛋白复合物组装及行使功能过程中发挥重要作用，充当支持蛋白质折叠的伴侣，促进蛋白质-蛋白质相互作用和各种亚基插入膜中，帮助辅因子附着到蛋白质亚基上，保护组装中间体免受降解及光氧化损伤。基于突变体分析、蛋白质相互作用研究和组装中间体的鉴定，提出了这些复合物的组装途径的大量假说。相比之下，关于细胞色素b6f (Cytb6f) 复合物的组装则知之甚少。近日，德国马克斯-普朗克分子植物生理学研究所Ralph Bock团队在Nature Communications杂志上发表了题为De-etiolation-induced protein 1 (DEIP1) mediates assembly of the cytochrome b6f complex in Arabidopsis的文章，提出去黄化诱导蛋白1（DEIP1）与复合物 PetA 和 PetB 的两个细胞色素亚基相互作用，并介导 Cyt b 6 f生物发生中中间体的组装。

Cytb6f是连接两个光系统的氧化还原偶联复合物，是由两个相同的单体复合物组成的二聚体。每个单体都由一个叶绿体编码的蛋白质 PetA（细胞色素f）、PetB（细胞色素b6 ）、PetD（亚基 IV）和细胞核编码的亚基 PETC（Rieske铁硫蛋白）形成的核心组成。质体编码的小亚基 PetG、PetL 和 PetN，以及细胞核编码的PETM位于复合物的外围，被认为有助于复合物稳定及调节复合物活性。为了寻找光诱导叶绿体生物发生的新调节因子，作者筛选了不同生长时期的烟草叶片 RNAseq 数据集以寻找对去黄化信号具有早期反应的基因，成功筛选到一个在光照60分钟后有明显诱导反应的基因，并命名为去黄化诱导蛋白1 （DEIP1）。利用T-DNA插入技术筛选了两个突变体，其中一个突变体在第一个内含子中含有 T-DNA 插入（ deip1-1），而第二个突变体在 5' 非翻译区含有 T-DNA 插入（deip1-2）。进一步使用基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑技术敲除DEIP1，选择编码区具有 1084 bp 大缺失的基因组编辑系（deip1-3）进行进一步分析。纯合的 deip1-1和deip1-3突变体叶绿素显著缺失，并且在中等光照条件下不能进行光合自养生长（图1 a）。亚细胞定位结果显示DEIP1定位于类囊体上，C 端暴露于基质侧，而 N 端可能暴露于类囊体膜的腔侧的跨膜蛋白（图1）。作者通过野生型和deip1-1、deip1-2和deip1-3突变体的脉冲幅度调制 (PAM) 测量探索了 DEIP1 在光合作用中的作用，发现deip1-1和deip1-3突变中体光系统 II 的最大量子产率 (F v /F m ) 和有效量子产率 (Φ II )、非光化学猝灭 (NPQ)  叶绿素荧光参数（qL）和电子传输速率（ETR）都显着降低（图2）。最后，作者检查了deip1-1、deip1-2和deip1-3突变叶绿体的形态和超微结构（图 3）。共聚焦激光扫描显微镜和透射电子显微镜显示，两种敲除突变体deip1-1和deip1-3的叶肉细胞中的叶绿体比野生型细胞和轻度敲除突变体deip1-2的更小。突变表型的表征表明，DEIP1 对光合自养生长至关重要，定位于类囊体膜上，是光合作用和叶绿体发育所必需的。

为了检测在敲除突变体deip1-1和deip1-3中观察到的叶绿素缺失表型是否是光氧化损伤的结果，植物在极低光照条件下（5 μmol m -2  s -1 ) 进行培养发现突变体与野生型表型类似，并且叶绿素含量相近。推测突变体表型是由于光合电子传递链的不平衡引起的，导致光氧化应激并引发类囊体膜中蛋白质复合物的快速破坏。通过免疫印迹分析研究了来自野生型和突变体幼苗的总蛋白提取物中主要类囊体蛋白复合物的积累。当幼苗在中等光照下生长时，观察到deip1-1和deip1-3 中Cytb6f亚基 PetA 和 PetB 完全缺失，而其他蛋白质复合物的亚基积累类似野生型水平(图4)。进一步通过天然蓝色聚丙烯酰胺 (PAA) 凝胶电泳 (BN-PAGE) 分析了在中等光照下生长的来自野生型幼苗和deip1-1、deip1-2和deip1-3突变体的类囊体样品的主要光合复合物。敲除突变体中不存在 Cytb6f复合物，并且在中等光照下生长的deip1-1和deip1-3中 PSII 超复合物、PSI/PSII 二聚体带和 LHCII 组装体丰度降低。

为了进一步探索 DEIP1 在 Cytb6f复合物积累中的作用，作者使用 BN-PAGE 和 2D-SDS-PAGE 分析从在中等光照和弱光下生长的一周龄deip1-1植株。在野生型中，检测到几种推定的 Cytb6f组装中间体，包括：(i) 三个含有 PetA 和 PETC（中间体 IV、V 和 VI）的复合物，(ii) 三个含有 PetB（中间体 II、III 和 V）的复合物，以及 (iii) 两个含有PetD（中间体 I 和 V；图 6a）。有趣的是，deip1-1突变体积累了PetA和PetC的单体形式，没有检测到中间体IV和VI。CO-IP和BiFC均表明DEIP1 与 Cytb6f亚基PetA 和 PetB 具有相互作用（图7-8）。

Cytb6f复合物通过在类囊体膜中将 PSII 与 PSI 功能连接起来，在光合作用中起核心作用。在这项工作中，确定并表征了一种蛋白质因子 DEIP1，它在 Cytb6f组装中起关键作用。DEIP1 是一种类囊体锚定蛋白，是 Cytb6f的生物发生所必需的。Cytb6f组装过程中PetB和PetA 共翻译插入类囊体膜,游离 DEIP1 作为二聚体存在。在类囊体膜中，PetD 与 PetB 和 DEIP1 以及可能的其他辅助因子结合。同时，PetA 与 PETC 和 DEIP1 相结合。DEIP1 与两种异二聚体的结合可能使这两个亚复合物非常接近，从而促进它们的结合。DEIP1 充当将 PetA 和 PetB 结合在一起的支架蛋白,使得不稳定的核心复合物向稳定的单体 Cytb6f转变，在此期间小亚基 PetL、PetG、PetN 和 PETM结合到复合体外侧。综上所述，该研究确定了类囊体膜中Cytb6f复合物的生物发生的重要组装因子DEIP1，通过与两种细胞色素PetA 和PetB 相互作用，促进了Cytb6f核心复合物的两个关键亚基的结合。DEIP1 的鉴定将有助于未来对 Cytb6f复合物具体组装途径的研究。

转自：植物生物技术Pbj

如有侵权，请联系本站删除！