一、 单细胞测序与肿瘤微环境研究
单细胞测序是近年来的热点组学技术，几乎已经应用在生物学研究领域的方方面面。相比健康的组织，肿瘤组织中的细胞构成更加多样，在个体间、组织内存在极高的细胞异质性。肿瘤组织高度复杂的细胞构成和基因调控方式，让单细胞测序的优势得到充分体现。因此，在诸多研究领域中，利用单细胞测序对肿瘤组织以及肿瘤微环境解析是最常见的研究方向之一。
但在肿瘤相关的单细胞研究中，涉及的细胞类型种类多样。而且不同文章研究的侧重点不同，还会针对某种细胞的子亚型开展解析（比如T细胞或者巨噬细胞的不同子亚型）。另外，文章中往往会结合肿瘤治疗的不同疗法，讨论肿瘤微环境的临床意义。因此，了解肿瘤微环境中的细胞构成、各类细胞的功能特征以及相应的针对性靶向疗法，将有助于我们读懂肿瘤相关单细胞测序文章，设计个性化的研究方案。
二、肿瘤微环境以及细胞构成
肿瘤中不仅只有癌细胞，而是由浸润细胞、常驻细胞、分泌因子和细胞外基质构成的异质集合。肿瘤细胞刺激宿主组织发生显著的分子、细胞和物理变化，以支持肿瘤生长和进展。肿瘤组织中影响肿瘤发展的复杂而丰富的多细胞环境，被称为肿瘤微环境（Tumor Micro Environment，TME）。一个新出现的TME是一个复杂且不断进化的实体。TME的组成因肿瘤类型而异，但标志性特征包括免疫细胞、基质细胞、血管和细胞外基质。
TME通常包括：
①免疫细胞(immune cells)包括T和B淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAM)、树突细胞(dendritic cells, DC)、自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)。
②基质细胞(stromal cells)如癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAF)、周细胞（pericytes）和间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells)。
③其他非细胞成分细胞外基质(the extracellular matrix, ECM)和其他分泌分子，如生长因子、细胞因子、趋化因子和细胞外囊泡(extracellular vesicles, EV), 以及血液和淋巴血管网络，它们共同交织在一起并肿瘤细胞产生互作。
在TME研究领域的早期，针对TME的靶向治疗被认为是有巨大前景的，原因有几个: 1) TME中的正常细胞被认为是遗传稳定的，因此比遗传不稳定的癌细胞更容易被靶向，也不容易形成耐药性；2）还有一种观点认为，针对TME细胞（如血管系统）的治疗可能是一种通用的方法，可以适用于任何癌症，不管它发生在哪个器官。
然而在过去几年中，研究人员逐渐意识到TME的复杂性，那些早期的观点可能过于乐观。在癌症发展的不同阶段和肿瘤发生的不同器官，TME中的同类细胞可以是肿瘤抑制性的或肿瘤支持性的。某类TME细胞是促癌还是抑癌受到癌症类型、TME细胞的发育阶段以及它们在肿瘤块位置影响。鉴于这种复杂性，已经开发了多种治疗TME的策略，包括消除促癌微环境细胞或将其“再培育”为免疫刺激、肿瘤抑制表型。
现在还认识到TME的确对肿瘤治疗干预的反应起重要作用，这可以表现为TME对肿瘤治疗存在的固有抗性，或获得性抗性。TME固有治疗抗性包括升高的间质流体压力和低效的血管供应，这两者都导致肿瘤块内药物的输送和分布受损。大量的免疫抑制细胞，包括TAMs和调节性T细胞(Treg)使肿瘤细胞亚群免受治疗效果的影响。关于获得性耐药，许多研究已经揭示了在一系列不同的治疗干预后对TME组成和表型的多效性适应效应。这些变化包括趋化因子产生的增加和随后免疫细胞的积累。事实上，放疗和化疗都可以增加肿瘤中具有免疫抑制作用的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的存在，保护癌细胞免于治疗诱导的细胞凋亡，这可能最终导致肿瘤复发。化疗还可能诱导基质细胞中的DNA损伤，导致NFκB的激活和WNT途径的上调，从而导致治疗耐药性。放射治疗由于影响肿瘤血管系统而导致TME的多效性改变，导致缺氧和随后的缺氧诱导因子1(HIF1)的激活，HIF1促进癌细胞存活和放射抗性。TME中的癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAF)也可以被激活，导致辐射诱导的纤维化，有利于赖氨酰氧化酶(LOX)的分泌，以及分泌更多细胞外基质(the extracellular matrix, ECM)，其通过整合素(integrin)促进癌细胞存活。
鉴于TME在肿瘤进展和调节癌症治疗的功效中的关键作用，近年来针对TME的策略已经显著扩展。这些方法主要集中于靶向TAMs、树突细胞、T细胞、肿瘤脉管系统、细胞外基质和CAF（图1），并将在以下部分进行讨论，重点是正在进行临床评估或已获批准的疗法。
三、免疫细胞(Immune cells)
1免疫细胞的基本组成免疫细胞是肿瘤微环境的关键组成部分。在不同的环境背景下，免疫细胞可以抑制肿瘤生长或促进肿瘤生长（图2）。由慢性感染引起的持续炎症是几种类型癌症（包括结直肠癌、肝癌和宫颈癌）中肿瘤形成的常见机制。广义而言，免疫细胞分为两类:适应性免疫细胞和先天免疫细胞。适应性免疫通过暴露于特定抗原而被激活，并使用免疫记忆来“评估”威胁并增强免疫反应。T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞属于适应性免疫反应。先天免疫是一种非特异性防御机制，在外来抗原进入身体后几小时内发挥作用。先天免疫细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞。
2T细胞以及相关疗法
T细胞是肿瘤微环境中最受关注的免疫细胞类型。每个T细胞都有独特的T细胞受体(TCR)，用于识别特定的抗原。在肿瘤微环境中，有几种不同的T细胞群影响肿瘤发生。细胞毒性T细胞(CD8+)检测癌细胞上表达的异常肿瘤抗原，并将它们作为杀伤目标。肿瘤微环境中细胞毒性T细胞的存在通常与癌症患者的较好预后相关。除了杀死肿瘤细胞，细胞毒性T细胞还通过分泌干扰素γ(IFN-γ)抑制血管生成。辅助型T细胞（CD4+）可以分化成多种亚型，从而在肿瘤微环境中协调广泛的免疫反应。I型T辅助细胞 (Th-1)是促炎性CD4+ T细胞，通过分泌白细胞介素-2 (IL-2)和IFN-γ支持CD8+细胞。肿瘤微环境中Th-1细胞水平的增加也与许多类型癌症的良好预后相关。调节性T细胞(Tregs)通常是抑制炎症反应和控制自身免疫所必需的。在肿瘤微环境中，Tregs无处不在，并通过抑制抗肿瘤免疫反应来促进肿瘤的发展和进展。例如，Tregs分泌IL-2，调节NK细胞的稳态和功能。此外，Tregs通过生长因子的分泌直接支持癌细胞的存活，并通过与基质细胞如成纤维细胞和内皮细胞的相互作用间接支持癌细胞的存活。肿瘤微环境中的免疫图谱分为三个主要类别：免疫浸润、免疫排斥和免疫沉默。1）在免疫浸润肿瘤中，免疫细胞（如细胞毒性T细胞）均匀分布在整个肿瘤中，表明存在主动免疫反应；2）一些肿瘤被归类为免疫排斥，在这种情况下，T细胞仅位于肿瘤的外围，并且没有渗透到肿瘤微环境中；3）一些肿瘤被归类为“免疫沉默”，完全缺乏免疫细胞浸润，表明对肿瘤没有免疫反应。
T细胞是目前免疫治疗最受关注的靶细胞。目前靶向T细胞的癌症免疫疗法包括：①通过抑制阻断免疫检查点来释放T细胞抗肿瘤功效；②过继T细胞疗法，包括过继嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors，CAR)或T细胞受体的基因工程T细胞来增强适应性免疫，即CART疗法与TCR-T疗法。另外还包括靶向树突细胞（DC）来增强DC介导的T细胞免疫（图3中的1~3点）。
（1）免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade，ICB)
T细胞活化的几种负调节因子可以作为检查点分子，紧密控制免疫系统，避免免疫过度活化。这些包括CTLA4和PD-1受体，它们代表了当前ICB疗法最常见的靶点。CTLA4在免疫应答的早期阶段调节T细胞增殖，并且主要在淋巴结中起作用；而PD-1被认为具有类似CTLA4的生物学效应，但其作用在外周组织内免疫应答的后期阶段。除了CTLA4和PD-1，还发现了其他免疫检查点分子，包括TIM3、LAG3分子和TIGIT蛋白，它们代表了T细胞免疫治疗的有吸引力的新兴靶点。
（2）CTLA4阻断
CTLA4由T细胞表达，并与抗原呈递细胞(APC)上的B7-1/B7-2共刺激分子结合。尽管几项临床前研究表明CTLA4阻断可在多种肿瘤类型起作用，但在具有更强抗炎TME的较大肿瘤中或在免疫原性较低的肿瘤中，未观察到显著影响。单克隆抗体ipilimumab对CTLA4的阻断对某些肿瘤尤其黑色素瘤结果非常积极，尤其是在患有黑素瘤的患者中。然而，对非小细胞肺癌、小细胞肺癌(SCLC)和前列腺癌的治疗结果并不显著。为了扩大可能受益于这种疗法的癌症患者的范围，目前正在进行许多针对不同类型实体瘤的临床试验，通常与其他药物联合使用。
（3）PD-1/PD-L1靶向治疗
在TCR刺激后，PD-1在T细胞上表达，并与PD-L1(也称为B7-H1)和PD-L2(也称为B7-DC)结合，两者都在APC上表达，并被促炎细胞因子上调。PD-1主要通过抑制效应T细胞和Tregs中的细胞内信号传导来限制免疫反应。与CTLA4相反，PD-1/PD-L1对于控制分化的效应细胞的持续活化和增殖是必需的。PD-1与PD-L1/2结合可介导T细胞凋亡或诱导T细胞功能障碍状态，通常称为T细胞衰竭。
2014年，Pembrolizumab和Nivolumab单抗疗法成为FDA批准的首个针对黑色素瘤患者的PD-1靶向免疫疗法。与CTLA4抗体ipilimumab相比，pembrolizumab显示出更好的6个月PFS（无进展生存期）和OS（总体生存率），并且具有毒性更低的额外优势。Pembrolizumab随后被批准用于治疗表达PD-L1的非小细胞肺癌、尿路上皮癌和头颈部鳞状细胞癌。Nivolumab产生了类似的有益结果。
PD-1的配体PD-L1也在调节免疫反应中起重要作用。PD-L1通常在APC上表达，可以控制Treg分化和免疫抑制活性。然而，肿瘤细胞和其他TME成分，如浸润性髓样细胞和树突状细胞，经常通过上调PD-L1来诱导T细胞衰竭，促进肿瘤生长和侵袭。通过阿替唑单抗(atezolizumab)靶向PD-L1于2016年首次被批准用于尿路上皮癌，并随后扩展到患有非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌和小细胞肺癌的患者，部分原因是与多西他赛(docetaxel)相比其毒性较低。其他抗PD-L1单克隆抗体，如avelumab和durvalumab，随后进入市场，用于治疗多种肿瘤类型，如尿路上皮癌、晚期肾细胞癌和非小细胞肺癌。与PD-1类似，阻断PD-L1对难治性癌症有效，并且有许多正在进行的临床试验潜在地改善了更广泛癌症的治疗结果。
尽管CTLA4和PD-1/PD-L1靶向策略已被证明是有效的，并能诱导持久的反应，但许多接受治疗的患者仍然对这些个体化治疗没有反应。由于CTLA4和PD-1在功能上存在相互补充，这两种策略的组合也被评估为增加应答率的手段。然而，由此产生的毒性是一个主要问题。在这方面，目前正在对大量肿瘤的II期试验中评估低剂量联合方案，从而在保持临床疗效的同时将毒性降至最低。
（4）LAG3抑制剂
LAG3信号被描述为T细胞活化、增殖和细胞因子产生的负调节因子。表达LAG3的细胞包括活化的CD4+和CD8+ T细胞、Tregs以及NK细胞、B细胞和pDC的亚群（浆细胞样树突状细胞）。这种蛋白质显示出与CD4受体的结构相似性，并且与MHC-II结合能力强于CD4。除了MHC-II，其他几种细胞表面蛋白包括半乳糖凝集素-3（galectin-3）、肝脏和淋巴结窦内皮细胞C型凝集素(LSECtin/CLEC4G)、α-sinuclein和纤维蛋白原样蛋白1 (FGL1)都与与LAG3结合。
LAG3的丰度以及TME中LAG3+细胞的浸润水平与几种类型肿瘤的疾病进展和不良预后有关，包括乳腺癌，非小细胞肺癌，以及肾细胞癌等。通过转移性卵巢癌的临床前研究揭示了LAG3与癌症免疫的功能相关性，该研究用抗PD-1抗体治疗导致LAG3和CTLA4水平增加，而用抗LAG3抗体治疗则会导致PD-1水平上调。这些实验表明，单剂免疫检查点阻断可能导致TME中其他免疫检查点分子的补偿性上调。事实上，联合阻断LAG3和PD-1协同增强了TME中的CD8+ T细胞毒性和减少的Tregs，从而抑制肿瘤生长。这些结果表明，LAG3类似于PD-1有助于免疫逃逸，并支持其作为癌症免疫治疗的有潜力的靶点。
（5）TIM3抑制剂
TIM3受体在多种细胞类型表达，包括T和B淋巴细胞、Tregs、NK细胞、DC、单核细胞、巨噬细胞和肿瘤相关内皮细胞。据报道，有四种配体与TIM3结合，包括半乳糖凝集素-9(galectin-9)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)和磷脂酰丝氨酸(PtdSer)。配体与TIM3结合导致T细胞应答的负调控以及T细胞凋亡。TIM3表达增加与实体瘤预后不良有关。对TIM3的阻断限制肿瘤生长而产生治疗效果，特别是与抗PD-1抗体联合使用时。有趣的是，一些临床前研究表明，TIM3抑制也调节DC功能和对乳腺癌化疗的反应，暗示了这个治疗靶点可能有更广泛的作用。
（6）TIGIT抑制剂
TIGIT是由NK细胞和T细胞表达的抑制性受体。CD155是TIGIT的主要配体，由APC和肿瘤细胞表达，并作为NK细胞和T细胞功能的负调节因子。TIGIT也可以通过干扰共刺激分子DNAM1或通过TIGIT胞质尾直接启动抑制性级联信号来发挥作用。近年来，TIGIT已成为癌症免疫治疗中有吸引力的靶点，因为它可以阻断多种抗肿瘤免疫机制。已经在几种肿瘤类型中观察到TIGIT上调，并且其表达与黑色素瘤、急性髓性白血病等的不良临床结果相关。
（7）过继T细胞疗法(Adoptive T-cell Therapy)
过继性T细胞疗法(ACT)是一种输血疗法，将成熟的T细胞亚群注入患者体内，以消除肿瘤细胞，并在理想情况下防止疾病复发。该领域中使用的最初实验策略包括从手术切除的样品中分离肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)，随后扩增并回输至患者体内。使用转移癌的早期临床前研究表明，ACT疗法在肺、肝和皮下肿瘤有成功的治疗效果。在转移性黑色素瘤治疗中，虽然大约三分之一的患者出现肿瘤消退，但平均反应持续时间仅为4个月，很少有患者出现完全应答。在这些初步试验后的二十年里，许多临床研究评估了使用TILs的ACT，在实体瘤中取得了部分成功。
TIL疗法的主要挑战之一是它依赖于具有抗肿瘤活性的功能性效应T细胞的存在，而这对于大多数癌症中缺乏此类细胞。此外，这些细胞在体外培养中的激活和扩增在技术上可能是困难的。因此，基因修饰T细胞的疗法是更有潜力的方向，包括TCR-T和CAR-T细胞疗法。这两种方法都涉及将患者自身的T细胞离体培养，通过基因工程技术使其表达识别肿瘤特异性抗原的受体，并将它们重新引入患者体内以促进T细胞介导的癌细胞杀伤。但这两种疗法在抗原识别机制方面有所不同。TCR-T细胞具有更宽泛的靶标，因为它们可以识别细胞外和细胞内抗原片段，但前提是抗原需要由MHC分子呈递，这是TCR-T细胞的局限性。尽管这些疗法已经在临床前模型和各种临床试验中证明是成功的，目前还没有FDA批准的基于TCR的T细胞疗法。
TIL和TCR-T细胞疗法只能靶向通过MHC/HLA呈递抗原的癌细胞，但CAR-T细胞则可以直接识别肿瘤细胞表面的靶分子。这是一个重要的区别，因为MHC/HLA分子在肿瘤中经常下调。在临床上，CAR-T细胞疗法已被证明对血液系统恶性肿瘤有良好的效果，导致FDA批准了三种针对CD19的独立CAR-T细胞疗法，用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病(tisagenlecleucel)、大B细胞淋巴瘤(axicabtagene ciloleucel)以及最近的套细胞淋巴瘤(brexucabtagene autoleucel)。除此之外，几种CAR-T细胞疗法目前正在临床试验中进行评估，以治疗其他亚型的淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。另一方面，迄今为止CAR-T细胞疗法对实体瘤效果有限，包括神经母细胞瘤。这主要是由于这些肿瘤的相当大的异质性和更复杂的TME的存在。
总之，基因工程T细胞在几种癌症中的应用非常成功。然而，未来还有几个挑战需要解决，包括毒性问题，新抗原的选择，以及克服免疫抑制性TME。
转自：基迪奥生物
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