Science Advances | 昆明理工大学牛昱宇/季维智发现碱基编辑技术会在猴子体内诱导广泛的RNA脱靶突变

编者按

碱基编辑器已被证明是通过直接纠正其原因来治疗遗传疾病的潜在方法，并且它们已成功地用于小鼠和猴子体内的疾病治疗。这些研究鼓励了进一步的临床前研究，以开发用于治疗人类疾病的碱基编辑器。然而，对基因编辑技术的脱靶效应的担忧仍然存在。

2022年7月22日，昆明理工大学牛昱宇及季维智共同通讯在Science Advances 在线发表题为“Cloning and base editing of GFP transgenic rhesus monkey and off-target analysis”的研究论文，该研究开发了一种称为体细胞核移植脱靶分析 (OA-SCNT) 的方法，用于评估最近报道的优化 ABEmax 在编辑猴子中诱导的 DNA 和 RNA 脱靶突变。

该研究首先展示了 ABEmax 通过 A-to-G 编辑 293T 细胞中的 GFP 序列使 GFP 沉默的能力。随后，使用来自表达 GFP 的猴子的供体细胞，成功地生成了 207 个 ABEmax 编辑 (SCNT-ABE) 和 87 个野生型 (SCNT) 胚胎，用于胚胎移植、基因分型以及基因组和转录组分析。使用称为 OA-SCNT 的新方法比较 SCNT-ABE 和 SCNT 胚胎进行脱靶分析，而不受遗传变异的干扰。ABEmax 不会诱导明显的 DNA脱靶突变，但会在编辑过的猴子胚胎中诱导广泛的RNA脱靶突变，其中 35% 是外显子。这些结果为ABE的临床应用提供了重要参考。

另外，2022年3月4日，昆明理工大学李天晴，牛昱宇及季维智共同通讯在Science Advances 在线发表题为“BRN2 as a key gene drives the early primate telencephalon development”的研究论文，该研究专注于 BRN2 (POU3F2)，一种编码在灵长类动物和小鼠中普遍表达的神经转录因子的基因。与对小鼠大脑发育的有限影响相比，BRN2 双等位基因敲除在食蟹猴 (Macaca fascicularis ) 中在妊娠中期前是致命的。组织学分析和单细胞转录组表明，BRN2 缺乏会降低 RGC 扩增，诱导早熟分化，并改变端脑神经发生的轨迹。BRN2，作为上游因子，控制神经节隆起的规范和分化。此外，该研究确定了 BRN2 在食蟹猴中对人类 RGC 的保守功能。BRN2 可能通过直接调节 SOX2 和 STAT3 并维持 HOPX 发挥作用。总之，该研究结果揭示了一种以前未知的机制，即 BRN2（一种保守基因）通过获得新的功能来驱动早期灵长类动物端脑发育。

胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 和腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 可以分别在单向导 RNA (sgRNA) 的靶位点催化 C 转化为 T 和 A 转化为 G。碱基编辑器已被证明是通过直接纠正其原因来治疗遗传疾病的潜在方法，并且它们已成功地用于小鼠和猴子体内的疾病治疗。这些研究鼓励了进一步的临床前研究，以开发用于治疗人类疾病的碱基编辑器。然而，对基因编辑技术的脱靶效应的担忧仍然存在。

几项研究表明，CBE 可以在小鼠胚胎和水稻中诱导脱靶 DNA 突变，并且 CBE 和 ABE 都可以在人体细胞中诱导脱靶 RNA 突变。这些结果引起了人们对临床使用碱基编辑器的效率和安全性的极大关注，并要求对这种方法的脱靶效应进行全面的体内分析。在碱基编辑器可以用于治疗人类疾病之前，需要证明它们的安全性。由于猴子和人类的密切遗传关系，非人灵长类基因编辑方法的脱靶分析可以为临床应用提供有用的参考。然而，由于遗传变异和技术限制，很难将脱靶突变与猴子个体中大量的单核苷酸多态性（SNP）区分开来，并准确评估脱靶效应。

在这里，该研究开发了一种称为体细胞核移植脱靶分析 (OA-SCNT) 的方法，用于评估最近报道的优化 ABEmax 在编辑猴子中诱导的 DNA 和 RNA 脱靶突变。简而言之，该研究首先使用来自表达 GFP 的 12 岁转基因恒河猴的供体细胞生成表达绿色荧光蛋白 (GFP) 的 SCNT 胚胎，并将 ABEmax 编码 mRNA 和靶向 GFP 的 sgRNA 注射到单细胞阶段的 SCNT 胚胎中。然后通过 GFP 表达区分编辑的 SCNT 和未编辑的 SCNT 囊胚。

对于 DNA 脱靶突变分析，对 SCNT-ABE 囊胚和组织、SCNT 囊胚和供体细胞分别进行全基因组测序 (WGS)。然后在所有样本中通过四种算法调用单核苷酸变体 (SNV)。最后，在 SCNT-ABE 样本中鉴定了脱靶突变，其中 SCNT 样本作为对照，供体细胞作为参考。对于 RNA 脱靶突变分析，该研究分别对 SCNT-ABE 和 SCNT 囊胚进行了 RNA 测序（RNA-seq），并由 GATK 调用 RNA SNV。然后在 SCNT-ABE 囊胚中鉴定出 RNA 脱靶突变，类似于 DNA 脱靶突变的分析。

SCNT 猴中 ABE 介导的 GFP 敲除（图源自Science Advances ）该研究首先展示了 ABEmax 通过 A-to-G 编辑 293T 细胞中的 GFP 序列使 GFP 沉默的能力。随后，使用来自表达 GFP 的猴子的供体细胞，成功地生成了 207 个 ABEmax 编辑 (SCNT-ABE) 和 87 个野生型 (SCNT) 胚胎，用于胚胎移植、基因分型以及基因组和转录组分析。使用称为 OA-SCNT 的新方法比较 SCNT-ABE 和 SCNT 胚胎进行脱靶分析，而不受遗传变异的干扰。 ABEmax 不会诱导明显的DNA脱靶突变，但会在编辑过的猴子胚胎中诱导广泛的RNA脱靶突变，其中 35% 是外显子。这些结果为ABE的临床应用提供了重要参考。昆明理工大学灵长类转化医学研究院牛昱宇教授、季维智院士为本文通讯作者，康宇博士、代绍兴副教授、王芳博士、博士研究生曾玉强为文章共同一作。

参考消息：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abo3123

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abl7263

转自：硕博一线

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