众所周知，己糖激酶（Hexokinase 2，HK2）是催化糖酵解途径中的第一步反应的关键代谢酶，将葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖，主要定位在线粒体外膜上。但HK2的作用不仅仅表现在糖酵解过程，它还有许多其不为人知的功能。今天为大家介绍的这篇发表在NCB上的文章揭示了HK2的新型非经典作用——定位至细胞核后调节基因表达和干细胞功能。
2022年6月24日，来自加拿大玛格丽特公主癌症中心的Aaron D. Schimmer团队在Nature Cell Biology（IF：28.2）上发表了题为“The metabolic enzyme hexokinase 2 localizes to the nucleus in AML and normal haematopoietic stem and progenitor cells to maintain stemness”的文章。研究人员发现，糖酵解途径中的关键酶己糖激酶 2（hexokinase 2, HK2）可以定位于AML和正常造血功能的干细胞和祖细胞的细胞核中。核定位的HK2以独立于其激酶和代谢功能的方式调控干细胞/祖细胞功能和分化。该研究描述了一种线粒体酶调节基因表达和干细胞功能的非经典机制。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41556-022-00925-9
背景介绍
急性髓系白血病(acute myeloid leukaemia，AML)的特征是未成熟髓系前体的克隆增殖与分化阻滞。与正常造血相似，AML是分层组织的，白血病干细胞(LSCs)负责补充大量AML细胞，并驱动长期克隆生长。尽管干细胞在正常和恶性造血中发挥着至关重要的角色，但调节白血病和正常干细胞生长和分化的因素尚未完全阐明。
线粒体中产生的代谢中间产物——包括乙酰辅酶A，α-酮戊二酸，S-腺苷甲硫氨酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸——通过作为核基因表观遗传修饰的辅助因子来调节干细胞功能和分化。类似地，代谢酶如异柠檬酸脱氢酶1和2 (IDH1和IDH2)的突变产生致癌代谢物，导致组蛋白和DNA甲基化增加，促进白血病发生和分化抑制。虽然已经描述了调节干细胞功能的代谢物，但对线粒体代谢酶知之甚少，线粒体代谢酶在细胞核中“moonlight”，直接影响基因表达、细胞分化和干细胞功能。
主要内容
1. HK2定位于白血病和正常造血干细胞的细胞核
为了探究这种传统定位于线粒体也可以在细胞核中发挥作用的蛋白，作者寻找了存在于8227细胞(低传代原发性AML模型)细胞核中的线粒体糖酵解酶和三羧酸循环酶，然后在8227细胞的细胞核中检测到HK2。相比之下，其他代谢酶（包括磷酸果糖激酶、延胡索酸酶、丙酮酸激酶2等）在核裂解液中并未检测到（图1a）。接下来，作者在7个原发性AML样本中也检测到了核HK2。进一步，根据活性氧水平的高低，作者将原发性AML样本分细分为白血病干细胞（stem population）和大量群体（bulk population），并检测了这两组样品中的核HK2水平。与bulk cells相比，干细胞核HK2的表达显著增强（1d）。
图1：（a）对FACS分选的干细胞和群体8227细胞的细胞核、细胞质和全细胞裂解液中的糖酵解酶和三羧酸循环酶进行western bloting；（d）细胞核HK2在AML (n = 25)和AML细胞系患者样本中的表达。
作者还探究了HK2在正常造血干细胞和祖细胞中的核表达和功能。造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）和多能祖细胞中HK2的核表达水平和总水平均较高，并随着细胞成熟而下降，分化细胞中核HK2的表达量最小（图2a）。正常脐带血中核HK2的过表达增加了这些细胞移植到小鼠体内的原发性和次级移植率（图2b，c）。进一步，作者构建了过表达核HK2的转基因小鼠（Vav-NLS-HK2），选择性地增加造血系统中的HK2。Vav-NLS-HK2小鼠骨髓中HSCs丰度及增殖能力显著增加，表明核HK2对正常HSCs的功能也很重要。
图2：（a）脐血造血细胞群中核HK2的荧光强度；（b）将富含CD34+的正常造血细胞与NLS1-HK2或对照载体一起转导，注入NOD/SCID-GF小鼠右股骨；（c）将（b）细胞注射到继发小鼠体内，8周后用流式细胞术检测移植效率
2. 核HK2过表达可以增加白血病干细胞特性并降低分化，敲低细胞核HK2促进分化并降低干细胞功能
为了检验AML干细胞和祖细胞功能是否需要核HK2，作者构建了c-Myc（NLS1, PAAKRVKLD）或SV40（NLS2, PKKKRKV）核定位信号标记的HK2，选择性地增加细胞核中的HK2，发现核HK2过表达可以抑制ATRA诱导的NB4细胞分化。进一步，HK2的过表达促进8227细胞植入小鼠骨髓（图3g）。作者接下来构建了特异性线粒体定位HK2载体OMMLS-HK2（outer mitochondrial membrane-localizing signal, OMMLS）。与对照细胞相比，表达OMMLS-HK2的细胞对2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）具有更强的抵抗性（图3b），表明线粒体标记的蛋白质具有代谢活性。随后，作者用靶向内源HK2的shRNA转导过表达OMMLS-HK2的细胞以消除核HK2，同时保留线粒体中的HK2（图3c）。结果显示，核HK2敲低后，（1）降低了NB4细胞的克隆生长（图3d）和8227 LSCs（CD34+CD38-）数量（图3f）；（2）减少了AML细胞在体内的生长和移植；（3）降低了与原始/干细胞样AML组分相关基因的表达，增加了细胞对ATRA的敏感性（图3d和e）；（4）降低了ATRA处理后CD34+CD38−干细胞的百分比（图3f）。这些数据表明，核HK2对于AML中的干细胞功能和分化至关重要。
图3：（a）使用蓝色荧光蛋白(BFP)表达载体，将8227个细胞转导为NLS1-HK2或对照。使用共聚焦显微镜对BFP分选细胞成像；（b）2-DG在OMMLS-HK2和对照NB4细胞处理48 h后的一半最大抑制浓度(IC50)；（c）AML患者体内ROS低的LSCs和ROS高的大块原代细胞中HK2的共聚焦显微镜图像。（d）用靶向HK2 UTR的shRNAs转导的OMMLS-HK2 NB4细胞的克隆生长，并用ATRA(100 nM)处理；（e）shRNA转导至HK2-UTR并经ATRA(100 nM)处理的OMMLS-HK2 NB4细胞中CD11b的表达水平；（f）8227个OMMLS-HK2和HK2-UTR shrna转导的细胞中CD34+CD38−细胞的百分率，与100 nM ATRA孵育或不孵育24小时；（g）将f细胞注射到继发小鼠体内，8周后用流式细胞术检测移植效率
3. 核HK2调控干细胞功能和分化不依赖于其激酶活性和代谢功能
作者接下来研究了HK2核定位的机制。总所周知，HK2是一种转移酶激酶，可将线粒体外膜处的葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸，开启糖酵解。那么HK2激酶活性是否是维持干细胞特性所必需的？Asp209和Asp657（D209A/D657A）的双重突变将使HK2完全丧失激酶活性。作者构建了一个带有c-Myc NLS标记的HK2突变体（NLS1-HK2 D209A/D567A）。在细胞中过表达NLS1-HK2 D209A/D567A后，用ATRA进行处理，依旧可以增强克隆生长和阻断细胞分化，与过表达野生型核HK2的表型类似（图4c,d）。因此，核HK2以一种独立于其激酶和代谢活性的方式维持干细胞和祖细胞功能。
图4：（c）经NLS1-HK2、NLS2-HK2或NLS1-HK2 D209A/D657A转导并经ATRA (100 nM)处理的NB4细胞中CD11b的表达;(d)由NLS1-HK2、NLS2-HK2或NLS1-HK2 D209A/D657A转导并经ATRA处理的NB4细胞的克隆生长。
4. HK2调节染色质开放性，增强DNA损伤反应
为了明确HK2调节干细胞功能的分子机制，作者通过邻近依赖生物素标记实验(BioID)并结合蛋白质谱分析对与HK2相互作用的核蛋白进行鉴定。通过该实验，证实了内源性HK2与MAX、SIRT1、IWS1、CTR9和SPIN1之间的相互作用（图5b）。随后，作者通过ATAC-seq发现，核HK2的过表达增加了染色质的可及性（图5c）。HK2与myc相关因子X（MYC-associated factor X，MAX）相互作用，MAX与细胞增殖、干细胞维持和分化以及DNA损伤响应有关，作者因此检测了stem和bulk AML群中的DNA损伤响应，并探究了核HK2是否会影响DNA损伤修复。在细胞中过表达核HK2后，用daunorubicin（一种插入化疗剂，可导致双链DNA断裂）处理细胞；然后，通过量化细胞核中γH2AX（双链断裂的替代标志物）、53BP1（介导非同源末端连接修复）和RAD51（同源重组）水平，在daunorubicin处理后的多个时间点检测双链DNA断裂和DNA修复蛋白的表达。结果显示，核HK2过表达增加了53BP1和RAD51水平，并减少了双链断裂的数量（图5h）。作者还比较了AML stem与bulk细胞中的DNA损伤反应。白血病干细胞对 DNA 损伤有反应，与同源重组和非同源末端连接相关的基因表达增加（图5k,i）。表明核HK2的过表达能够增强细胞的DNA损伤反应。
图5：（b）NB4细胞内源性HK2和MAX、SIRT1、IWS1、CTR9和SPIN1的PLA信号强度;(c)在NB4细胞中过表达NLS1-HK2后，通过ATAC-seq测量染色质可及性;(h)彗星实验检测了8227个NLS1-HK2转导细胞与70 nM柔红霉素孵育6 h前后的差异; (k) 在50 nM柔红霉素治疗0和3小时后，AML(AML151258)患者的原始样本中茎和体部分的γH2AX水平;从两种生物样本中选取一种，检测225个细胞。(l)AML (AML151258)患者在接受50 nM柔红霉素治疗3小时后，其主要样本的茎和体部分中53BP1的水平;从两种生物样本中的一种中检测了N = 111个细胞。
研究总结
该研究发现了传统意义上的线粒体代谢酶己糖激酶2(HK2)在白血病和正常造血干细胞中定位于细胞核。核HK2过表达能够增加白血病干细胞特性，降低分化，而细胞核HK2选择性敲低则促进分化，降低干细胞功能。核HK2定位依赖于磷酸化，需要积极的输入和输出，并独立于其激酶活性调节分化。HK2与核蛋白相互作用调节染色质开放，增加白血病干细胞阳性信号位点和DNA修复位点的染色质可及性。细胞核HK2过表达减少双链断裂并产生化疗耐药性，这可能有助于白血病干细胞抵抗DNA损伤剂的机制。基于上述，作者描述了一个非典型的机制，通过线粒体酶影响干细胞功能并独立于其代谢功能。
转自：“学术查”微信公众号
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