中国药科大学：二氢丹参酮I改善心肌缺血再灌注损伤的机制新发现

近期，中国药科大学研究团队在ACTA PHARM SIN B（IF=14.903）发表题为“Dihydrotanshinone I preconditions myocardium against ischemic injury via PKM2 glutathionylation sensitive to ROS”的文章。该研究揭示了二氢丹参酮I（DT）通过诱导瞬时ROS生成，触发PKM2谷胱甘肽化促进其核转位，进一步稳定HIF-1α，从而在心肌缺血损伤中起到预处理保护作用。该研究展示了PKM2如何感知ROS信号，从而为ROS作为关键缺血预处理信号提供了新的证据。

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研究背景

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心肌缺血是指由于冠状动脉狭窄导致的心肌供血不足,造成心肌缺血缺氧，是一种危及生命的疾病。一旦发生心肌缺血，关键的治疗方法是通过溶栓或机械手段清除阻塞恢复血供，但血液供应的恢复会导致缺血再灌注损伤，其危害远超最初的缺血损伤。缺血预处理（Ischemic preconditioning, IPC）是一种保护心脏免受缺血再灌注损伤的潜在干预手段，但其在缺血损伤中作用机制尚不清楚。二氢丹参酮I (Dihydrotanshinone I, DT)是从丹参（心血管疾病常用药）中提取的生物活性成分，本研究从IPC角度阐明DT在心脏缺血损伤中的作用。

本研究所用AAV病毒由维真生物荣幸提供！

病毒产品

AAV9-cTnT-shPKM2；

AAV9-cTnT-wildtype PKM2；

AAV9-cTnT-mutants PKM2；

实验动物

雄性5周龄C57BL/6小鼠

病毒用量

200 µL；4×10E11vg

注射方式

 尾静脉注射

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研究方法与结果

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1、DT预处理保护心脏免受损伤

研究表明DT预处理通过诱导少量活性氧（ROS）产生保护心肌细胞。研究者利用小鼠HL-1细胞检测了DT对ROS生成的作用，结果证实DT预处理可诱导少量ROS产生，并能在氧糖剥夺（OGD）条件下有效维持心肌细胞存活，但DT对心肌细胞的保护作用可被ROS清除剂NAC减弱。研究者还进一步研究了DT在异丙肾上腺素(ISO)刺激的大鼠中的保护作用，发现DT给药降低了ISO处理鼠的HW/BW比值，缩小了ISO诱导的梗死区域，同时降低CK（肌酸激酶）和LDH（乳酸脱氢酶）水平，并能维持心肌细胞正常状态；但NAC减弱其保护功能。这些结果表明DT预处理对心脏的保护作用。

2、DT促进PKM2核转位

先前的研究表明，DT给药可诱导少量ROS释放并稳定HIF-1α（缺氧诱导型转录因子），但其确切靶点和机制尚不清楚。由于HIF-1α主要定位在细胞核中进行转录调控，研究者对DT处理的心肌细胞核进行了蛋白质组学分析，分析结果表明HIF-1α信号通路和PKM2（丙酮酸激酶亚型）在DT预处理中发挥重要作用。进一步的实验分析表明DT预处理促进了PKM2以二聚体的形式进行核转位，PKM2敲除影响了DT预处理的保护作用，说明DT预处理以PKM2依赖的形式维持细胞存活。上述结果表明DT通过促进PKM2核转位发挥预处理保护作用。

3、DT通过诱导PKM2核转位增强HIF-1α转录活性

有证据表明PKM2在细胞核中作为辅助因子促进HIF-1α的转录激活。研究者通过免疫沉淀(IP)实验表明，DT处理增强了核内HIF-1α的积累以及PKM2和HIF-1α的互作，PKM2敲除细胞中DT的作用被减弱。进一步分析证实DT通过抑制依赖泛素化的HIF-1α降解增强其蛋白表达水平。荧光素酶报告基因实验证实，DT增加了HIF-1α启动子的活性，但这种作用在PKM2沉默后被抑制。此外，数据表明DT以PKM2依赖的方式诱导HIF-1α靶基因（Il10, Pdk1, Hmox1 and Vegfa）在预处理调控中表达。Kpna1基因产物介导PKM2的核转位，敲除Kpna1显著降低了PKM2的核转位和核内HIF-1α的积累，但HIF-1α敲除对PKM2的核内积累没有显著影响。这表明：PKM2在信号级联中作用于HIF1α的上游，DT以依赖核内PKM2的方式增强HIF-1α活性，进而促进下游靶基因的表达，发挥预处理作用。

4、PKM2/HIF-1α的相互作用依赖于ROS的产生

接下来，研究者探究了ROS生成对DT介导的PKM2核转位的影响。数据表明ROS清除剂mitotempol (Mito-T)、tiron和二硫苏糖醇（DTT）可以消除DT对HIF-1α积累和PKM2核转位诱导的影响，并降低DT对HIF-1α和PKM2相互作用的增强及对HIF-1α靶基因的诱导。低浓度的H2O2（一种ROS）处理心肌细胞能发挥与DT预处理同样的功能，包括HIF-1α的核内积累、PKM2核转位、HIF-1α和PKM2核内互作及HIF-1α靶基因的诱导表达，敲除PKM2后上述预处理保护作用被减弱。这些结果表明PKM2的核转位及其与HIF-1α的相互作用对ROS敏感。

5、谷胱甘肽化促进PKM2的核转位

ROS通过氧化半胱氨酸残基诱导蛋白质谷胱甘肽化调节氧化还原通路，氧化的PKM2是否会对进一步的谷胱甘肽化更加敏感呢？研究者对此展开了分析，DT处理增加了培养细胞中GSSG/GSH比例，同时外源GSSG的补充进一步诱导了PKM2的谷胱甘肽化，并增加了细胞核内PKM2和HIF-1α的含量。下拉实验表明GSSG直接与PKM2结合。过表达Glrx1（催化去谷胱甘肽化的酶）可抑制PKM2核转位并降低HIF-1α积累，同时IP检测证实DT可增加细胞核内谷胱甘肽化PKM2的含量。这些结果表明：DT通过诱导ROS产生，提高了GSSG的含量；GSSG通过谷胱甘肽化修饰促进PKM2核转位。

作者进一步明确了PKM2的谷胱甘肽化修饰位点。谷胱甘肽主要与蛋白的半胱氨酸结合，对10个PKM2中已知的半胱氨酸进行了突变，发现C423/424位点的半胱氨酸突变会影响DT对核PKM2积累的诱导。DCP-Bio1探针用于检测半胱氨酸氧化，DT处理增加了DCP-Bio1与PKM2的结合，但PKM2突变体（C423A, C424A和C423/424A）的相互作用受损。IP实验也证实了PKM2在Cys423和Cys424位点的突变减少了谷胱甘肽化形式。值得注意的是，与Cys423位点相比，PKM2的Cys424位点更容易被谷胱甘肽修饰。上述结果表明：PKM2的Cys423和Cys424为谷胱甘肽化修饰位点。

6、DT预处理保护依赖PKM2的谷胱甘肽化

最后，研究者求证了PKM2谷胱甘肽化是否是DT发挥预处理保护作用的潜在机制。结果显示，AAV载体介导的PKM2敲低及其突变体过表达，显著减弱了DT预处理后PKM2的谷胱甘肽化、核HIF-1α的积累和下游基因的表达。DT预处理有助于改善心肌缺血后的预后，表现为DT处理使心肌结构正常化，并抑制胶原沉积，但这些保护作用被PKM2敲除及突变减弱。此外，DT在野生型或PKM2过表达小鼠中减少了MI导致的心肌坏死面积和预后心脏组织纤维化区域，恢复了射血分数（EF）和缩短分数（FS）的损失，但在PKM2敲除或突变小鼠中，DT没有发挥明显的保护功能，以上结果表明：DT预处理对心脏缺血损伤有保护作用，还能促进缺血损伤后的恢复。

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结论

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PKM2对细胞氧化还原状态的改变很敏感。DT通过诱导少量ROS的生成，触发PKM2谷胱甘肽化并促进其核转位。在细胞核中，PKM2与HIF-1α相互作用，激活下游预处理调控相关靶基因的表达，从而缓解了心脏的缺血损伤。这一发现扩展了我们对PKM2氧化修饰的认识，并表明IPC在无再灌注心脏缺血损伤保护中的潜力。

转自：“如沐风科研”微信公众号

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