中国科学院陈玲玲团队开发新的系统，追踪发育胚胎中的转录记忆和mRNP出核

催化死亡的CRISPR-Cas13 (dCas13)系统已被用于在没有遗传操作的情况下可视化活细胞中的RNA。而了解多细胞生物中单细胞中的基因转录和mRNA-蛋白(mRNP)动态一直具有挑战性。

2023年1月19日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）陈玲玲团队在Genome Biology（IF=18）在线发表题为“CRISPR-dCas13-tracing reveals transcriptional memory and limited mRNA export in developing zebrafish embryos”的研究论文，该研究通过CRISPR-dCas13追踪揭示了斑马鱼胚胎发育中的转录记忆和有限的mRNA输出。该研究报道了纯化的CRISPR-dCas13荧光蛋白和修饰的引导RNA的合子微注射，可以在没有遗传操作的情况下，从合子基因组激活(ZGA)到早期分割期，对斑马鱼胚胎中发育表达的mRNA进行单色和双色跟踪。

使用这种方法，该研究发现了等位基因之间的非同步新生转录，等位基因对中的同步有丝分裂后再激活，以及转录记忆作为一种外部噪声，可能有助于同步有丝分裂后反应激活。作者还发现，dCas13参与的mRNP在细胞核中快速运动，具有围栏和扩散运动，但限制mRNP输出的速率范围很广，可以通过Alyref和Nxf1过表达缩短。这种优化的基于dCas13的工具包能够对内源性mRNA进行稳健的时空跟踪，并揭示转录和mRNP运动的特征，为多细胞发育生物中的内源性RNA可视化提供了强大的工具包。

基因表达在所有生物中都是必不可少的，包括RNA转录、剪接、输出、翻译和降解的无缝协调步骤。RNA成像技术已被用于在动态视图中剖析这些分子事件。单分子荧光原位杂交(smFISH)已被证实可以在固定细胞中可视化RNA，但在活细胞中，特别是在体内，以高空间和时间分辨率了解转录动态和mRNA输出的方法仍然有限。

MS2-MCP系统使用噬菌体MS2的外套蛋白(MCP)，将串联RNA茎环标记到感兴趣的RNA上。该系统已广泛应用于分析细菌、哺乳动物细胞和小鼠的RNA动力学。类似地，PP7-PCP系统为RNA跟踪提供了另一种可视化工具，并与MS2-MCP结合使用，实现了双色RNA可视化。最近，催化死亡(d) RNA引导酶和RNA靶向RNA酶(称为Cas13家族)融合到荧光蛋白已被用于跟踪人类细胞中的mRNA和/或局部富集的长非编码RNA。这些基于CRISPR-Cas13的技术，特别是Cas13系统，由于其识别单链RNA的天然能力，与广泛使用的MS2-MCP系统相比，提供了一种简单且更省时的工具来可视化RNA，无需基因操作。然而，CRISPR-dCas13系统在追踪内源性mRNA方面的敏感性和鲁棒性仍需提高，其在发育中的生物中的应用仍未被探索。

图1.发育中的斑马鱼胚胎的非同步从头转录（图源自Genome Biology ）

将多个MS2适配体连接到报告基因或异位或内源性基因，可以观察到转录爆发、有丝分裂期间的转录记忆遗传以及等位基因间转录的相关性。然而，应用MS2-MCP系统来观察多细胞生物内源性位点的转录谱是一个挑战，一些研究显示果蝇胚胎中MS2工程位点的转录爆发和远程基因调控。此外，在多细胞生物的发育过程中，随机噪声如何影响从一个细胞周期到另一个细胞周期的等位基因间的转录波动仍有待解决。因此，开发一个强大的非遗传CRISPR-dCas13系统对于研究多细胞生物中内源性等位基因的新生转录和有丝分裂后转录再激活具有重要意义。

图2.利用CRISPR-dCas13系统在斑马鱼胚胎中观察从头起始转录和mRNP运动

前期研究表明，CRISPR-dCas13系统可以标记活细胞中的RNA。作者的研究通过建立一个简单的CRISPR-dCas13系统来跟踪多细胞生物中的异位和内源性RNA，扩大了这一在胚胎发育中的应用。这使人们在高时空分辨率下能够描述转录动态和mRNP运动，这表明这种优化的CRISPR-dCas13系统可以作为多细胞生物内源性RNA可视化的强大工具包。

分子细胞卓越中心陈玲玲研究组的博士后黄友葵为本论文第一作者，陈玲玲研究员为通讯作者。该研究的合作者包括复旦大学生物医学研究院杨力研究员、中科院生物大分子卓越创新中心李栋研究员，该研究同时得到科技部、中科院稳定支持基础研究领域青年团队项目、国家自然科学基金委、上海市科委、分子细胞卓越中心、霍华德·休斯医学研究所、科学探索奖以及中国博士后科学基金等项目的资助。

原文链接：

https://doi.org/10.1186/s13059-023-02848-6

转自：“iNature”微信公众号

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