2023/6/16 9:31:56 阅读：238 发布者：
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分享发表在Pharmacological Research上的论文“Integrating network analysis and experimental validation to reveal the mitophagy-associated mechanism of Yiqi Huoxue (YQHX) prescription in the treatment of myocardial ischemia/reperfusion injury”。杂志影响因子10.334.这篇文章的网络药理学分析相对简单，实验验证很充分。
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摘要
心肌缺血/再灌注（I/R）损伤是导致缺血后心力衰竭增加的主要原因，目前尚无确切的治疗方法。研究表明，氧化应激诱导的线粒体功能障碍在心肌I/R的病理发展中起着重要作用。本研究开发了益气活血方（YQHX），作为一种中草药配方，并显示其可以减轻I/R损伤。网络分析结合超高效液相色谱-高分辨率质谱分析阐明了YQHX的活性成分，揭示了YQLX治疗I/R损伤的线粒体自噬调节机制。体内实验证实，YQHX显著减轻I/R心肌损伤，缓解氧化应激。体外实验证实YQHX可以缓解缺氧/复氧损伤并通过改善线粒体的结构和功能来减轻氧化应激，这与调节线粒体自噬密切相关。总之，本研究表明，YQHX可以通过靶向线粒体自噬减轻I/R损伤，可能是心肌I/R损伤的潜在治疗策略。
一. 研究路线
二.YQHX对体内心肌I/R损伤模型的影响
动物实验证明：YQHX减轻心肌I/R损伤（图1A-C);YQHX降低了心脏损伤生物标志物CK和LDH(图1D-E）；YQHX提高SOD和MDA水平（图1F-G）。
图1。YQHX对心肌I/R损伤的影响。（A） 通过TTC染色评估心肌梗死。（B） 各组心肌梗死面积条形图。（C） I/R损伤小鼠心肌组织的病理变化。显示了苏木精和伊红（H&E）染色的代表性切片。（D，E）各组LDH和CK水平的条形图。（F，G）各组SOD和MDA水平的条形图。
三、网络药理学研究
UPLC-HRMS法鉴定YQHX中的化合物
利用UPLC-HRMS建立了YQHX的质量控制方法，并对YQLX的化合物进行了鉴定。典型的基峰色谱和离子流色谱如图2A所示。根据标准和相关数据库，初步鉴定了YQHX中共23种主要化合物（图2A）。化合物类别包括有机氮化合物、嘌呤核苷、羧酸及其衍生物、吲哚及其衍生物、异黄酮、类黄酮、有机氧化合物、酚类、异戊二烯脂质、羟基酸及其衍生物、羧酸及其衍生品。表1中提供了每种化合物的详细表征。
YQHX潜在化合物对心肌I/R损伤的靶标预测
从数据库和文献中收集了YQHX中总共495种化合物（表S1）。随后，通过UPLC-HRMS获得的和上述数据库的结果的交集，筛选了23个核心化合物（图2A）。根据上述方法预测和筛选了这23个核心化合物的803个潜在靶标（图2B，表S2）。此外，从DisGeNET、Genecards、TTD和CTD中获得了1071个用于治疗I/R损伤的治疗靶点（图2B，表S3）。为了探索YQHX在心肌I/R损伤中的潜在靶点，生成了Venn图。最后，237个共同靶点被认为是YQHX对抗心肌I/R损伤的潜在靶点（图2B，表S4）。
网络分析
为了进一步评估潜在靶标的重要性，将237个共同靶标上传到STRING 11.0数据库进行分析。根据严格的筛选标准（combined score>0.7），将237个靶标纳入网络拓扑分析，构建了相互作用网络。该网络由237个节点和1601条边组成，平均节点度为13.5。在网络拓扑分析和上述筛选原理的基础上，选择了拓扑特征值（度、节点介数和接近度）大于中值的90个关键靶标（图2C，表S5）。
图2。YQHX治疗心肌I/R损伤的网络分析。（A） 利用UPLC-HRMS对YQHX中的23个主要化合物进行了鉴定；从数据库和文献中收集了YQHX中包含的495种化合物；最终筛选出23个化合物作为YQHX的推定和代表性化合物。（B） YQHX和心肌I/R损伤的237个共同靶点的维恩图。（C） 通过STRING网络拓扑分析从237个共同靶点中获取90个关键目标。（D） YQHX的草药、关键靶点和重要通路之间的相关性。黄色节点是指YQHX中含有的十二种草药；绿色节点是指关键靶标；蓝色节点指的是信号通路；绿线指的是草药和关键靶标之间的关系。蓝线指的是关键靶点和信号通路之间的关系。
功能富集分析
为了阐明这90个关键靶标的潜在功能，通过使用Metascape平台进行了基因注释和功能富集分析（图3，表S6）。前15个GO生物过程涉及治疗心肌I/R损伤的四个主要方面，包括减轻氧化应激、抑制细胞凋亡、抑制炎症和调节自噬（图3B）。此外，前15个GO分子功能与蛋白激酶活性、蛋白结构域特异性结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合、一氧化氮合酶调节活性等有关（图3B）。
此外，前15个GO细胞成分是膜微结构域、线粒体包膜、溶酶体、线粒体膜等（图3B）。KEGG信号通路的富集表明，YQHX治疗心肌I/R损伤主要涉及以下个方面：细胞死亡相关信号通路（如凋亡和坏死）、内分泌抵抗相关信号通路，炎症反应相关的信号通路（如TNF、toll样受体、NOD样受体和MAPK通路）和自噬相关的信号途径（如自噬、线粒体自噬、吞噬体和mTOR通路）（图3A）。
PPI网络和MCODE富集分析
为了进一步研究潜在的机制，通过应用MCODE算法构建了一个模块化网络来揭示核心治疗靶点。MCODE算法用于从PPI网络中识别高度相关的网络靶标，总共生成了五个重要的模块（图3C，表S7）。为了探索不同模块中靶标的潜在功能，使用Metascape进行了功能富集分析。富集分析表明，模块1、2、3和5参与多种生物过程、细胞成分、分子功能和KEGG信号通路（表S8）。此外，模块4的富集分析集中在线粒体和自噬（尤其是线粒体自噬）上（表S9）。具体而言，前三个生物过程包括线粒体分解、线粒体自噬和细胞器分解。前三种细胞成分包括线粒体外膜、线粒体膜和细胞器外膜。此外，分子功能与泛素-蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接蛋白结合和蛋白结构域特异性结合有关（图3D）。最显著富集的KEGG信号通路是线粒体自噬-动物（图3E）。这些结果说明YQHX治疗心肌I/R损伤的机制可能与减轻氧化应激和调节自噬有关。
图3。对关键靶标进行功能富集和模块化分析。（A） 前20个显著富集的KEGG途径。（B） 前15个显著丰富的生物过程、分子功能和细胞成分。（C） 网络中的MCODE模块：灰色节点是MCODE模块1中的核心基因；黄色节点是MCODE模块2中的核心基因；在MCODE模块3中，浅绿色节点是核心基因；蓝色节点是MCODE模块4中的核心基因；深绿色节点是MCODE模块5中的核心基因。（D） MCODE模块4在生物过程（蓝色部分）、分子功能（黄色部分）和细胞成分（浅绿色部分）中的最高富集项。（E） 前5个显著富集了KEGG途径中MCODE模块4的项。
6.通过分子对接验证已鉴定化合物与关键靶标之间的相互作用
图4。分子对接结果。（A） YQHX中关键靶标与23种活性化合物结合的对接得分热图。（B） 关键靶点和化合物的代表性对接复合体。
四、体外验证YQHX对H/R损伤模型的潜在机制
1.YQHX在体外减轻了H/R损伤
H/R损伤模型已被公认为模拟体外I/R损伤的经典和理想模型。CCK8测定表明，与对照组相比，H/R干预显著降低了H9c2细胞的相对生存力（P<0.001）。如图5A和B所示，结果表明，与H/R模型组相比，YQHX治疗减轻了由H/R损伤引起的相对生存能力的降低（P<0.05）。此外，还检测到心脏损伤生物标志物CK和LDH，与对照组相比，H/R损伤组显著增加（P<0.05）。相反，阳性对照组（ADO组）与H/R损伤对照组相比逆转了CK的上述趋势（P<0.05），与H/R损伤组相比，不同剂量的YQHX降低了CK和LDH的水平（P<0.05）。总之，在体外H/R损伤模型中，YQLX提高了H9c2细胞的相对活力，并降低了CK、LDH的水平（图5C、D）。
2.YQHX减轻了H/R损伤模型中的氧化应激
为了研究氧化应激，检测了经典的氧化应激生物标志物MDA和SOD的水平。与体内实验结果一致，与对照组相比，MDA水平显著升高，作为经典氧化应激生物标志物的SOD水平显著降低。相反，与H/R损伤组相比，阳性对照组（ADO组）逆转了MDA和SOD的上述趋势（P<0.05）。此外，与H/R损伤组相比，不同剂量的YQHX显著降低了MDA水平，并以剂量依赖的方式增加了SOD水平（P<0.05）（图5E，F）。由于ROS在激活氧化应激中的关键作用，通过流式细胞术测定了ROS的DCFH-DA荧光强度。如图6所示，与对照组相比，H/R损伤组ROS的荧光强度显著升高。与H/R损伤组相比，ADO处理显著降低了ROS的荧光强度（P<0.05）。此外，不同剂量的YQHX处理与H/R伤害组相比，在不同程度上降低了活性氧的荧光强度。基于上述结果，表明YQHX可以通过减少ROS的产生和提高氧化应激指数SOD和MDA来缓解体外H/R损伤模型中的氧化应激。
图5。YQHX对体外H/R损伤的影响。（A） 各组H9c2细胞形态变化的光镜图像。（B） 每组中相对细胞活力的条形图。（C，D）各组LDH和CK水平的条形图。（E，F）各组MDA和SOD水平的条形图。（G） 通过流式细胞仪测量各组中ROS的产生水平。
3.YQHX改善了H/R损伤模型中的线粒体功能障碍
过量ROS的产生会损害线粒体功能，导致心肌细胞的进一步再灌注损伤。ATP的产生是线粒体的一项重要功能；从而检测ATP含量。结果显示，与对照组相比，ATP含量显著降低。与H/R损伤组相比，ADO治疗显著增加了ATP含量（P<0.05）。此外，不同剂量的YQHX治疗显著增加ATP含量，并呈剂量依赖性（P<0.05），MMP是线粒体呼吸功能的另一个重要指标；因此，通过TMRM测量各组的MMP荧光强度。如图6所示，与对照组相比，H/R损伤组的MMP荧光强度显著降低。与H/R损伤组相比，ADO治疗显著增加了荧光强度（P<0.05）。此外，MYQHX和HYQHX组的荧光强度也显著增加（P<0.05），YQHX保护H9c2细胞的线粒体功能免受H/R损伤（图6B，C）。
图6。YQHX对体外H/R损伤线粒体功能的影响。（A） 各组MMP的荧光图像。（B） 每组细胞内ATP含量的条形图。（C） 各组TMRM/Hoechst相对荧光强度的条形图。
4. YQHX保护线粒体形态，防止H/R损伤导致的自噬体（AP）和自噬多体（ASS）的产生
为了进一步探讨YQHX是否能对H/R损伤的线粒体发挥保护作用，利用TEM观察了各组线粒体形态。如图7A所示，计算了自噬体（AP）和自噬多聚体（ASS）的数量，与对照组相比，H/R损伤组的自噬体和自噬多聚体的数量显著增加（P<0.05）。然而，与H/R损伤组相比，ADO和不同剂量的YQHX治疗组的AP和ASS数量显著减少（P<0.05）（图7A）。此外，H/R损伤导致线粒体形态发生明显变化，细胞器的平均长度和宽度增加证明了这一点（P<0.05）。与对照组线粒体的完整结构相比，H\/R损伤组线粒体出现空泡化，嵴线粒体被破坏。相反，ADO和不同剂量的YQHX处理改善了线粒体形态，线粒体的平均长度和宽度显著减少（P<0.05）（图7B）。基于TEM结果，YQHX在体外H/R损伤模型中保护线粒体形态，并抑制AP和ASS的产生。
图7。YQHX对体外H/R损伤线粒体自噬的影响。（A） 每组中ASS和AP的量的代表性TEM图像和柱状图。（B） 各组线粒体超微结构的代表性TEM图像和线粒体平均面积的条形图。
5. YQHX抑制H/R损伤模型中自噬和线粒体自噬靶点的表达
根据网络分析和现有证据筛选出的关键靶点，YQHX可能通过调节自噬和线粒体自噬来减轻H/R损伤。因此，通过蛋白质印迹检测自噬和线粒体自噬相关靶点的蛋白质表达。首先，确定了经典和代表性的自噬相关蛋白（mTOR、Beclin1、p62和LC3B）。与对照组相比，H/R损伤组mTOR和p62的相对蛋白表达水平显著降低，而Beclin1的表达水平和LC3BII/LC3BI比值显著升高（P<0.05）。相反，与H/R损伤组相比，ADO组和不同剂量的YQHX组上述蛋白质的表达趋势显著逆转（P<0.05）（图8A-F）。
此外，线粒体自噬（动物）是KEGG途径富集分析的另一个关键结果，而YQHX可以改善H/R损伤模型中的线粒体功能和结构，因此推测YQLX可能通过抑制线粒体自噬来提供线粒体保护。因此，确定了主要的线粒体自噬相关蛋白（PINK1、Parkin、BNIP3和Nix）。与对照组相比，H/R损伤组的PINK1、Parkin、BNIP3和Nix的相对表达水平显著增强（P<0.05）。然而，上述蛋白质的相对表达与H\/R损伤组相比显著降低（P<0.05）（图8G-K）。根据上述结果，在体外H\/R损伤模型中，YQHX可能通过抑制自噬和线粒体自噬对H9c2细胞的功能和结构发挥保护作用。
图8。YQHX对体外H/R损伤的预测靶点表达的影响。（A-F）各组中mTOR、p62、Beclin1、LC3BI和LC3BI相对表达的代表性蛋白质印迹图像和条形图。（G-K）各组中Nix、BNIP3、PINK1和Parkin相对表达的代表性蛋白质印迹图像和条形图。
参考文献
Chen M, Zhong G, Liu M, He H, Zhou J, Chen J, Zhang M, Liu Q, Tong G, Luan J, Zhou H. Integrating network analysis and experimental validation to reveal the mitophagy-associated mechanism of Yiqi Huoxue (YQHX) prescription in the treatment of myocardial ischemia/reperfusion injury. Pharmacol Res. 2023 Mar;189:106682. doi: 10.1016/j.phrs.2023.106682. Epub 2023 Feb 1. PMID: 36736970.
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