2023/6/1 14:30:04 阅读：171 发布者：
来源：
撰文︱苏语涵 刘秀兴 张淳
睡眠是一项重要的生理活动，在维持人体免疫功能和健康状态方面起着重要作用。然而，由于睡眠时间缩短和睡眠质量恶化对健康的不利影响，睡眠不足已成为一个重要的公共卫生问题 1。人口研究报告显示，熬夜已成为全球性的问题，发达国家和发展中国家的熬夜率均呈上升趋势 2。多项流行病学和实验研究发现，睡眠不足与心血管疾病、代谢紊乱、中风、癌症和神经退行性疾病的风险增加有关 2。此外，睡眠不足还与自身免疫性疾病，如类风湿关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化症的发病风险增加有关 2, 3。
苏文如教授团队关注睡眠不足对免疫系统和临床疾病的影响，已在 Nature 子刊（Liu X, et al. Commun Biol. 2021）发表文章探究了睡眠不足对免疫细胞和免疫反应的影响 4，团队利用单细胞技术分析了健康人群熬夜整晚后血液免疫细胞的变化，提供了睡眠不良对免疫系统影响的全面概括。因此，睡眠不足对免疫系统的不利影响可能导致自身免疫性疾病和炎症性疾病的发生。
自身免疫性葡萄膜炎 (Autoimmune uveitis, AU) 是一种常见的致盲性自身免疫性疾病，约占致盲人数的 10-25%5, 6。熬夜与 AU 的临床复发相关，这进一步导致了疾病的进展，增加了药物使用、治疗费用和社会负担。小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental autoimmune uveitis, EAU) 是 AU 常用的动物模型，可用于 AU 的发病机制研究。颈部引流淋巴结 (Cervical drain lymph nodes, CDLNs) 是 AU 和 EAU 发生发展的关键部位，能促进抗原和免疫细胞的引流，其中抗原呈递的髓系细胞和淋巴细胞 (如 Th17 细胞) 与视网膜抗原发生反应，并招募炎症细胞穿过血眼屏障，从而引起组织炎症损伤 7。此外，睡眠不足对淋巴结免疫细胞的作用也值得关注。据报道，睡眠不足改变了淋巴结内淋巴细胞和中性粒细胞的比例 8。因此，探索睡眠不足与 CDLNs 中免疫细胞之间的联系，以及睡眠不足影响 AU 和 EAU 病情发展的免疫机制，特别是寻找睡眠不足相关自身免疫性疾病的关键治疗靶点至关重要。
近日，中山大学中山眼科中心 & 眼科国家重点实验室苏文如教授和郑颖丰教授团队，与中南大学湘雅医院王祥珪教授团队合作，在 Clinical and Translational Medicine 杂志发表了题为 Sleep loss potentiates Th17-cell pathogenicity and promotes autoimmune uveitis 的文章 9。基于质谱流式细胞术（Cytometry by time of flight，CyTOF），单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）等单细胞技术和流式细胞术等验证性实验，研究者收集分析了 6 名健康人睡眠缺失前后外周血单个核细胞（PBMCs）的特性和变化，探究了睡眠不足对人体免疫系统的影响。此外，研究者通过构建小鼠睡眠剥夺和 EAU 模型，并分析其 CDLNs 的 scRNA-seq 数据，探讨了睡眠不足对免疫系统和 AU 发生发展的影响和机制，证实睡眠不足增强了 Th17 细胞的分化和致病性，通过增加 GM-CSF 分泌和 IL-23-Th17-GM-CSF 的反馈机制促进了 AU 的疾病进展。
这也是继 2021 年苏文如教授/郑颖丰教授团队首次构建睡眠不足影响人体血液免疫细胞的单细胞图谱，揭示睡眠不足作用和疾病风险增加的规律后，在睡眠不足与疾病关系领域的又一重要贡献。
专家点评
文章发表后，四川大学华西医院著名眼底病专家徐筑萍教授同期在 Clinical and Translational Discovery 杂志撰写了题为 GM-CSF signaling in Th17-cell pathogenicity: The culprit in autoimmune uveitis promoted by sleep loss 的专题评述。
苏文如教授领衔的多团队合作，在前期探究了睡眠不足对人群血液免疫细胞和免疫反应的影响的基础上 4，进一步探究了睡眠不足对葡萄膜炎这类致盲性眼免疫性疾病的作用和机制。这项研究模拟人类和小鼠的睡眠不足状态，综合运用 CyTOF、scRNA-seq、流式细胞术、ELISA 等技术，从单细胞角度探索了睡眠不足对健康个体及自身免疫性葡萄膜炎小鼠免疫系统的影响。
此外，苏文如教授团队通过 EAU 小鼠模型研究了睡眠不足对自身免疫性葡萄膜炎发病机制的影响。他们发现睡眠不足会加重 EAU，并极大引起 Th17 细胞的分化和致病性相关基因和途径上调。苏文如教授团队验证了睡眠不足可增加 IL-23 刺激后 Th17 细胞表达的 IL-23R 和 GM-CSF 水平，并增强 Th17 和抗原呈递细胞之间的 GM-CSF 及其受体间相互作用，最终证明 IL-23-Th17-GM-CSF 反馈机制是睡眠不足导致 EAU 加重的罪魁祸首，并创新性地提出抗 GM-CSF 疗法可能对睡眠不足诱导的葡萄膜炎临床复发发挥治疗效果。
该评述高度肯定了苏文如教授团队在熬夜相关领域的重大突破，重点指出并称赞了研究者所发现的睡眠不足可通过分泌 GM-CSF 和 IL-23-Th17-GM-CSF 反馈机制增强 Th17 细胞致病性，认为靶向 GM-CSF 将会是很有潜力的治疗自身免疫性葡萄膜炎的方法。
研究结果
基于 CyTOF 和 scRNA-seq，研究者就睡眠不足对正常人和小鼠的影响构建了睡眠不足的免疫细胞图谱。研究者发现，睡眠不足改变了正常人 PBMCs 和小鼠 CDLNs 中免疫细胞，尤其是效应 CD4+ T 细胞和髓系细胞的组成和功能。生信分析发现，睡眠不足可促进正常人及小鼠中 CD4+ T 细胞、B 细胞和髓系细胞的分化和活化，增加其炎症和自身免疫相关基因的表达。值得注意的是，睡眠不足小鼠 Th17 细胞中 GM-CSF 基因 Csf2 和树突状细胞中 GM-CSF 受体基因 Csf2rb2 的表达均较高，这与睡眠不足后正常人 CD4+ T 细胞中 GM-CSF 水平升高相一致。GM-CSF 在炎症和自身免疫性疾病中发挥重要作用 10。这些结果揭示了睡眠不足会导致免疫环境的改变，诱导炎症和自身免疫状态，且提示 GM-CSF 在睡眠不足诱导的疾病中的潜在作用。
图 1. The effects of sleep loss on immune cells.
图源：Liu X, et al. Clin Transl Med. 2023
睡眠不足加重小鼠 EAU 发病和自身免疫反应
基于单 CyTOF 和 scRNA-seq 中发现的睡眠不足可诱导自身免疫倾向，研究者在小鼠中构建了睡眠剥夺和 EAU 模型，进一步探究睡眠不足对 EAU 发病机制的影响。根据临床评分和病理评分，研究者发现睡眠不足使小鼠 EAU 症状和视网膜折叠加重。在正常小鼠和睡眠不足小鼠 CDLNs 的 scRNA-seq 基础上，研究者还对 EAU、接受睡眠剥夺的 EAU 和对照组小鼠的 CDLNs 细胞进行了 scRNA-seq，以探索睡眠不足对 EAU 特异性病理免疫反应的影响。生信分析发现，EAU 特别增加了 Th17 细胞分化、体液免疫反应以及髓系细胞分化，且这些影响在睡眠不足后更为明显。值得注意的是，研究者证实 Th17 细胞是睡眠不足和 EAU 影响自身免疫性疾病进展的关键病理细胞。他们发现睡眠不足诱导的 EAU 恶化与 Th17 细胞中分化和致病性相关的基因和通路的上调有关。在 EAU 小鼠中，睡眠不足促进了 GM-CSF 基因 Csf2 和 IL-23 受体基因 Il23r 的表达，上调了 Th17 细胞中 IL-23 信号通路。通过细胞间通讯分析，研究者发现睡眠不足增加了细胞间的相互作用，进而增强了 Th17 细胞和髓系细胞的激活、分化和趋化性。这些结果表明，睡眠不足促进了 EAU 特异的病理免疫反应，特别是 Th17 细胞致病性。
图 2. The effects of sleep loss on Th17 cells during EAU.
图源：Liu X, et al. Clin Transl Med. 2023
睡眠不足通过 IL-23-Th17-GM-CSF 反馈机制增强 Th17 细胞致病性
Th17 细胞的致病性对 AU 和 EAU 的病情发展至关重要。Th17 细胞的致病性是通过细胞因子的分泌来表现的，分泌的细胞因子结合到其他细胞，如髓系细胞表面的受体，导致细胞分化和活化。应用流式细胞术，研究者验证了睡眠不足提高了 Th17 细胞表达 GM-CSF 和 IL-23R 的水平，二者都是介导 Th17 细胞致病性的重要分子。此外，研究者发现抗 GM-CSF 抗体能抑制睡眠不足诱导的 EAU 恶化，表明 GM-CSF 和 Th17 细胞致病性在 EAU 发展中的重要性。为了探索睡眠不足诱导 Th17 细胞致病性的特异性介质，研究者通过综合比较分析来预测对各组 scRNA-seq 数据中不同细胞亚群间的相互作用。研究者发现，不论是睡眠不足后还是 EAU 模型建立后，GM-CSF 与其受体之间的相互作用都存在于 Th17 细胞和髓系细胞之间。且这种细胞间相互作用在睡眠不足后增强，进而促进了 T 细胞活化、Th17 细胞致病性以及髓系细胞活化和迁移。
图 3. The effects of sleep loss on GM-CSF signaling interaction during EAU.
图源：Liu X, et al. Clin Transl Med. 2023
为此，应用流式细胞术和 ELISA，研究者验证了 Th17 细胞来源的 GM-CSF 可促进 CD11C+细胞分泌 IL-23 和表达 CCR2，且靶向 GM-CSF 可减少这一通路并抑制 EAU 小鼠 CD11C+细胞浸润。因此，睡眠不足增加了 Th17 细胞来源的 GM-CSF 水平，通过 GM-CSF-髓系细胞- IL-23 的信号通路促进髓系细胞的活化、细胞因子分泌 (IL-23) 和细胞迁移 (CCR2) 。此外，研究者还证实了睡眠不足后 EAU 小鼠中 Th17 细胞表达 IL-23R 的比例增加，且在 IL-23 刺激后 Th17 细胞中 IL-23R 和 GM-CSF 的水平升高。这些结果揭示了 GM-CSF 分泌增加以及 IL-23-Th17-GM-CSF 正反馈循环是睡眠不足后 EAU 加重的关键机制。为了探究这一机制应用于自身免疫疾病临床治疗的可能性，在 EAU 模型的临床前研究基础上，研究者进一步收集了健康人群，早期 AU 患者和 SL 诱导的复发性 AU 患者的血液样本。睡眠不足诱导的复发性葡萄膜炎患者定义为：在排除饮食、药物、情绪等因素后，由于工作或者其他原因导致短期熬夜，使得病情稳定的患者出现 AU 临床复发的症状。对于睡眠不足引起的复发性葡萄膜炎患者，研究者采用常规疗法进行治疗，并收集了治疗稳定后 1 个月的血液样本。研究者发现，睡眠不足增加了健康个体和 AU 患者外周血中 Th17 细胞中 GM-CSF 和 CD14+单核细胞中 IL-23 的水平，并增加了血清中 IL-17A、GM-CSF 和 IL-23 的水平，这与研究者在 EAU 小鼠中的发现一致。
图 4. The serum levels of IL-17A, GM-CSF, IL-23 in AU patients.
图源：Liu X, et al. Clin Transl Med. 2023
文章结论与展望
在本研究中，通过综合运用高通量 CyTOF、scRNA-seq、流式细胞术、ELISA 等技术，模拟人类和小鼠体内的睡眠不足情况，探讨了睡眠不足对免疫细胞和免疫功能的影响。重要的是，研究者首次揭示了睡眠不足通过促进 GM-CSF 分泌和 IL-23-Th17-GM-CSF 反馈机制增强 Th17 致病性，进而导致 AU 的发生发展。针对这些病理变化，研究者创新性地提出并验证了靶向抑制 GM-CSF 治疗睡眠不足后加重的 EAU 有效性，且确定 GM-CSF 是治疗熬夜等睡眠不足情况诱导的 AU 复发的靶点，为睡眠不足诱导的自身免疫性疾病临床复发提供了一种新的治疗方法。在未来的研究中，可以进行更大规模的临床前和临床试验，探索抗 GM-CSF 药物在临床应用中的有效性和安全性。
图 5. Graphical abstract.
图源：Liu X, et al. Clin Transl Med. 2023
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ctm2.1250
据悉，中山大学中山眼科中心苏文如教授和郑颖丰教授，中南大学湘雅医院王祥珪教授为共同通讯作者。中山大学中山眼科中心研究生刘秀兴，苏语涵，黄兆豪，吕健阶，谷晨阳为共同第一作者。研究得到了国家优秀青年科学基金项目和国家自然科学基金的资助。
通讯作者：苏文如
（照片提供自：中山大学中山眼科中心苏文如团队）
通讯作者简介：
苏文如，主任医师，博士研究生导师。「国家优青」基金获得者，「广东省杰青」基金获得者，临床上擅长葡萄膜炎等各种眼免疫性疾病和眼底疾病的诊断和治疗。目前主要研究方向为眼科免疫炎症性疾病的基础及临床研究，发表通讯和第一作者论文 68 篇，其中 IF>10 论文 15 篇，IF>20 分论文 2 篇。获广东省科技进步一等奖 1 项，授权发明专利 3 项。如有兴趣申请苏教授实验室博士后，请发 Email 至：suwr3@mail.sysu.edu.cn，具有眼免疫学和生物信息学背景者优先。
转自：“丁香学术”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
