中科院2区-大连民族大学:代谢组学分析揭示了红参中精氨酸双糖苷对小鼠急性肝损伤的保护作用

导读

人参（Panax senging Meyer）具有优异的抗炎作用，它含有多种活性人参皂苷成分，对多种肝脏损伤具有治疗作用，如改善肝功能、调节免疫功能、减少炎症和细胞凋亡以及保护肝脏免受损伤。红参是由新鲜人参通过传统中药加工方法，如蒸制和干燥制备而成。红参也被证明具有保肝作用，一些研究表明，这种作用可能主要与加工过程中产生的稀有人参皂苷Rg3、Rh2和CK有关。在加热过程中，除了形成更罕见的人参皂苷外，人参中含有的麦芽糖和精氨酸化合物也会发生美拉德反应，产生精氨酸双糖苷（AFG）。作为红参中典型的非皂苷类活性成分之一，AFG具有良好的抗氧化、抗炎和促进微循环的作用。然而，研究者目前尚不清楚AFG是否具有肝保护作用。在本研究中，我们旨在探究AFG对D-氨基半乳糖（D-GalN）和脂多糖（LPS）联合诱导的小鼠急性肝损伤（ALI）的肝保护作用。我们进行了代谢组学研究，以阐明AFG对ALI的肝保护作用机制。我们在肝脏样品中鉴定出8种代谢产物，可作为AFG肝保护作用的潜在生物标志物。通路分析表明，AFG的肝保护作用与氨基酸代谢和氧化应激有关。氨基酸定量结果显示，AFG预处理后4-羟基脯氨酸（Hyp）、高精氨酸（Harg）、a -氨基己二酸（Aad）、β -丙氨酸（β -Ala）和2-氨基丁酸（Abu）水平出现显著变化。此外，AFG预处理减弱了上调的核因子e2相关因子2（Nrf2）和血红素氧合酶1（HO-1），并增强了肝脏中多药耐药蛋白2（Mrp2）的表达水平。这些结果表明，AFG对ALI具有良好的肝保护作用，AFG有望成为一种具有肝保护作用的功能性食品。

本研究亮点：

1. AFG对D -半乳糖胺和脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤有保护作用；

2. 通过代谢组学分析，8种代谢物被确定为AFG保护肝脏作用的潜在生物标志物；

3. AFG处理促进了部分氨基酸的合成，减轻了氧化损伤；

4. AFG对于肝损伤的保护机制与Nrf2信号通路的激活有关。

论文ID

原名：Metabolomics and targeted amino acid analysis reveal the liver protective effect of arginyl –fructosyl -glucose from red ginseng on acute liver injury in mice

译名：代谢组学和靶向氨基酸分析揭示了红参中的精氨酸双糖苷对小鼠急性肝损伤的保护作用

期刊：Journal of Functional Foods

IF：5.223

发表时间：2023.02

通讯作者：弓晓杰，李珂珂

通讯作者单位：大连民族大学生命科学学院以及生物技术与资源利用教育部重点实验室

实验设计

实验结果

1. 病理组织学检查情况

如图1A所示，模型组（Mod）的肝组织呈紫黑色，并表现出显著的病理改变，包括大量细胞坏死、细胞质疏松、细胞肿胀、细胞质空泡化和间质细胞浸润情况。通过AFG预处理后，这些组织病理学改变被缓解。具体而言，炎性细胞浸润减少，肝细胞整齐排列，细胞形态相对完整。肝脏颜色也变得正常。

图1 AFG处理对LPS/ GalN诱导的小鼠ALI以及小鼠血清转氨酶水平和肝脏氧化应激水平的保护作用（平均值±标准差（SD），n = 6）

（A）代表性肝脏的形态学以及代表性苏木精和伊红（H&E）染色肝脏切片的图像（400×倍放大）；（B）血清丙氨酸转氨酶（ALT）水平；（C）血清天冬氨酸转氨酶（AST）水平；（D）肝脏过氧化氢酶（CAT）活性；（E）肝脏谷胱甘肽（GSH）活性；（F）肝脏中丙二醛（MDA）活性；（G）肝脏超氧化物歧化酶（SOD）活性。将模型组与对照组进行比较，或将AFG组与模型组进行比较，*（p < 0.05）和**（p < 0.01）代表具有显著性差异。

2. AFG对LPS/D- GalN诱导的血清ALT和AST水平升高的影响

对血清中的相关指标分析发现，模型组的血清ALT和AST水平显著高于对照组（Con）（图1B - C）。AFG预处理后，血清转氨酶活性的增加明显逆转。

3. AFG对氧化应激参数的影响

如图1 D -G所示，模型组（Mod）肝匀浆中的MDA含量增加，SOD、CAT和GSH活性下降，尤其是SOD活性显著下降（p < 0.05）。然而，与模型组相比，AFG组在不同剂量处理下的GSH、SOD和CAT活性均呈剂量依赖性增加。此外，AFG预处理后，MDA水平降低。

图2 三个不同组的肝脏代谢组学

（A）主成分分析（PCA）得分图。（B -D）来自三个不同组中的正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）评分图。（E）维恩图分析。*表示该代谢产物具有回调功能。Con：对照组；Mod：LPS/ GalN诱导组；AFG：AFG处理组（100 mg/kg）。

4. 代谢物的多元统计分析

我们通过PCA和OPLS-DA分析来可视化和评估匹配条件的代谢特征，以识别实际聚类。通过分析，我们发现对照组（Con）、模型组（Mod）和AFG组之间存在显著的代谢差异（图2 A -D）。对照组与模型组之间存在显著差异，此结果提示LPS/ D-GalN诱导了显著的生化变化。AFG组的样品与对照组的样品聚类更接近，表明AFG可在一定程度上逆转LPS/ D-GalN诱导的ALI代谢紊乱。

根据OPLS-DA的结果（图2 B-D），通过比较对照组和模型组，我们共筛选并鉴定了53种差异代谢物。将AFG组与Model组进行比较，我们从中筛选出37种差异代谢产物，包括氨基酸、羧酸和衍生物。维恩图显示了在三个不同组中差异和重叠的代谢物，以及共同发生变化的代谢物列表。在这些代谢产物中，模型组中天冬氨酸-苯丙氨酸（Asp-phe）和2, 4-二乙酰氨基-2, 4, 6-三苯氧基-D-吡喃糖下调，乙酰-L-肉碱、肉碱C20：1和肉碱C20：2上调。AFG预处理后，这五种代谢产物恢复到正常水平。然而，模型组中三种上调的代谢产物，N-乙酰天门冬氨酰谷氨酸、7-酮脱氧胆酸和5-羟基吲哚-3-乙酸在AFG组中仍然上调。

图3 肝脏代谢途径分析

（A）LPS/ GalN诱导组和AFG组之间代谢途径的影响。（B）基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库，用示意图阐述LPS/ D-GalN诱导的ALI和AFG调节的代谢网络。

5. 代谢通路分析

我们根据KEGG数据库分析了与本研究中获得的代谢产物相关的特定途径。结果表明，6种代谢途径（赖氨酸降解、谷胱甘肽代谢、胆汁分泌、β -丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢）（富集因子大于0.1，图3A）是AFG对ALI肝保护的最大贡献通路。此外，通过使用KEGG数据库关联主要代谢途径，我们对LPS/D-GalN诱导的ALI和AFG调节进行了示意性代谢网络分析（图3B）。

图4 肝脏样本中检测到的50种氨基酸的热图

颜色表示丰度增加（绿色）或减少（红色），强度反映相应的浓度，按行进行数据标准化。

表1 三组小鼠肝脏中50种氨基酸及相关胺的含量

a三组之间方差分析的P值。

b从OPLS-DA模型中产生的投影变量重要性（VIP）值。

6. 肝脏中氨基酸的定量结果

每个肝脏样本中氨基酸水平的结果显示在热图中（图4）。我们基于50种氨基酸和衍生物的浓度进行统计分析。根据OPLS-DA模型中VIP >1.0的阈值和单变量统计分析得出的结果（p < 0.05），我们观察到三组之间氨基酸出现显著变化。OPLS-DA评分的散点图如图5所示。表1列出了小鼠中的详细氨基酸谱及其p值和VIP。这些结果表明，LPS/ GalN和AFG显著影响4-羟基脯氨酸（Hyp）、高精氨酸（Harg）、a -氨基己二酸（Aad）、β -丙氨酸（β -Ala）和2-氨基丁酸（Abu）的代谢途径。

图5 根据肝脏中的氨基酸水平结果，得到的OPLS-DA中得分散点图

Con：对照组；Mod：LPS/ GalN诱导组；AFG：AFG处理组（100 mg/kg）。

7. AFG处理对核因子e2相关因子2（Nrf2）、血红素氧合酶1（HO-1）和多药耐药蛋白2（Mrp2）表达的影响

如图6所示，LPS/ D-GalN诱导Nrf2和HO-1的表达增加，但Mrp2的表达水平似乎保持不变。AFG预处理减弱了LPS/D-GalN引起的Nrf2和HO-1的上调，表明AFG可显著减轻小鼠ALI。此外，AFG组中Mrp2的表达水平明显增强，表明AFG通过激活负责谷胱甘肽缀合物分泌的Mrp2而显示出抗氧化活性。

图6 AFG（100 mg/kg）处理对HO-1、Nrf2和Mrp2蛋白表达的影响

Con：对照组；Mod：LPS/ GalN诱导组；AFG：AFG处理组（100 mg/kg）。

讨论

AFG是红参中具有代表性的非皂苷成分，具有多种药理活性。然而，AFG对LPS/ D- GalN诱导的ALI的影响尚未有研究者报道。为了解释AFG对小鼠肝脏保护作用的分子机制，我们对此研究了组织病理学和生化指标的变化以及代谢途径的变化。

肝脏的氧化应激与LPS/ GalN诱导的ALI相关。酶依赖性抗氧化系统在肝脏保护作用中起着关键作用。由于AFG抑制MDA水平的升高，并增加SOD、CAT和GSH的活性，其保肝作用可能与其抗氧化能力有关。研究还表明，AFG预处理通过调节氧化应激改善顺铂（CDDP）诱导的肾脏损伤，并减少链脲佐菌素（STZ）诱导的肝脏氧化应激。本研究进一步证明，AFG通过其抗氧化能力发挥药理作用。

作为一种重要的转录因子，Nrf-2协调细胞的抗氧化防御。HO-1是一种主要的细胞保护抗氧化剂，可抑制LPS/ D-GalN诱导的氧化损伤引起的白细胞反应，改善肝脏微血管灌注。一旦受到氧化应激刺激，HO-1的表达可以被Nrf2激活。Mrp2是Nrf2下游转运蛋白，它介导胆盐、胆红素葡萄糖醛酸结合物、谷胱甘肽缀合物和水溶性阴离子化合物的分泌。Nrf-2调节多药耐药蛋白（Mrp）外排转运蛋白和肝脏解毒酶的表达，从而降低细胞的氧化负荷，发挥抗氧化作用，防止肝脏损伤。在本研究中，AFG处理降低了ALI小鼠中Nrf2和HO-1的表达水平，并提高了Mrp2的表达水平。这些结果表明AFG通过调节Nrf2信号通路显示出抗氧化和解毒作用活性。然而，具体机制需要后续进一步研究。

GSH是肝细胞中主要的内源性抗氧化剂，GSH代谢紊乱可导致许多肝脏疾病。据报道，活性氧（ROS）诱导的氧化损伤与LPS/ D- GalN诱导的暴发性肝损伤有关。谷胱甘肽的代谢与抗氧化防御有关，有助于维持正常的肝功能。在本研究中，模型组GSH代谢下调，GSH的还原形式发生了显著变化，如半胱氨酸-甘氨酸（Cys- Gly）和γ- L-谷氨酸-半胱氨酸。AFG预处理后，GSH代谢上调，Cys-Gly、亚精胺和辅酶II（β- NDP）发生显著变化。此外，AFG显著抑制MDA活性，提高SOD、CAT和GSH活性，表明AFG的肝保护作用可能与其抗氧化能力有关。

在氨基酸代谢中，共有5个VIP大于1且p小于0.05的氨基酸被鉴定为三组中变化最显著的氨基酸。β-丙氨酸（β-Ala）可作为神经递质或激素调节分子来调节体内代谢，还可作为各种活性物质（如辅酶a、泛酸）的中间代谢物。此外，β-Ala还能缓解疲劳，提高运动性能和记忆力，并发挥抗衰老作用。在本研究中，受损肝脏中的β-Ala水平升高。AFG预处理后，β -Ala水平降低，表明AFG可以缓解这种扰动。a-氨基己二酸（Aad）被认为是氧化应激、衰老、前列腺癌症和糖尿病的可靠生物标志物。2-氨基丁酸（Abu）也与氧化应激有关，是AST介导的半胱氨酸生物合成途径的副产物，该途径与GSH代谢有关。Abu增加细胞内GSH水平并保护细胞免受氧化应激。在本研究中，AFG预处理抑制了模型组中Abu和Aad水平的升高。Hyp是胶原蛋白的特征成分之一，可作为评价胶原蛋白组织代谢的重要指标，它反映了胶原组织纤维化的程度。作为肝纤维化中氧化损伤的指标，研究者们检测肝细胞中Hyp蛋白的表达，以评估moniliformediquinone的抗肝纤维化潜力。在本研究中，受损肝脏中Hyp水平升高，AFG逆转了这种升高，表明AFG干预可以通过显示抗纤维化作用来减轻LPS/ D-GalN诱导的ALI。Harg是一种非蛋白质氨基酸，已成为健康维护和疾病治疗的新贡献分子。低Harg水平与心血管风险增加、肾损伤、中风、衰老和动脉粥样硬化相关。然而，Harg在肝功能障碍中的作用机制仍然尚不清楚。在本研究中，LPS/ D-GalN降低了肝脏中的Harg水平，我们在AFG组中未检测到Harg的存在。

精氨酸和脯氨酸代谢被确定为LPS/ D-GalN诱导ALI动物中AFG调节的代谢途径之一（图3 A和B），这与先前的发现一致。精氨酸可以促进谷胱甘肽的合成，增强细胞的抗氧化能力，抑制促炎分子。脯氨酸是一种特殊的非必需氨基酸，可以抵抗氧化和内质网应激，维持细胞氧化还原平衡。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢也得到了促进，如图3 A所示。丙氨酸是一种重要的非必需氨基酸，也是细胞的重要能量底物。它与肝脏糖异生途径和白细胞代谢有关。谷氨酸代谢与抑郁症和肝脏损害最相关。我们的研究表明，肝损伤小鼠的丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸和天冬氨酸水平升高，但AFG预处理后我们仍观察到它们的升高趋势。这些结果表明，AFG促进了这些氨基酸的合成，以抵消氧化应激。同样，AFG预处理后赖氨酸水平也呈增加趋势。赖氨酸在促进人体生理发育和脂肪酸氧化中起着关键作用。赖氨酸主要在线粒体中分解代谢。赖氨酸降解可能与肝肾损伤和早期心肌肥厚有关。在这项研究中，赖氨酸降解是AFG预处理后ALI小鼠中改变的途径之一。AFG逆转了模型组中上调的肉碱C20：1和其他脂肪酰基。我们推测AFG可能会将线粒体中与赖氨酸降解相关的酶的活性恢复到正常水平。

红参是由新鲜人参经过加热和干燥处理后制成的，在加工过程中产生了一系列副产物，如麦芽酚和AFG。麦芽酚已被证明对糖尿病、肾脏疾病和神经系统具有抗氧化活性。AFG还显示出显著的抗氧化、抗炎和促进微循环的作用。因此，我们后续有必要进一步研究红参制剂中副产物的保健和药用价值。近年来，AFG的药物功能日益受到关注，这项研究为AFG治疗ALI提供了深入的见解，并证明了AFG作为肝脏保护剂的潜力。

结论

红参是一种著名的营养补充剂，以其抗氧化特性而闻名。AFG是红参制备过程中的副产物，具有良好的抗氧化和抗炎作用。在本研究中，我们基于代谢组学分析研究了AFG对LPS/ D-GalN诱导的小鼠ALI的肝保护作用和机制。八种代谢产物被鉴定为AFG对小鼠急性肝损伤的肝保护作用的主要原因。氨基酸定量结果表明，Hyp、Harg、Aad、β- Ala和Abu对AFG的肝保护作用最为重要。此外，AFG的抗氧化活性与Nrf2信号通路的激活有关。我们研究中的数据表明，AFG对ALI具有良好的肝保护作用。未来有望开发成为具有保肝作用的功能性食品。

原文链接：  

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1756464623000737

转自：“如沐风科研”微信公众号

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