前期基础太多了研究内容怎么写？-立项依据与研究内容的实验分配

如果立项依据都把story探究完了项目还有进行的必要吗？评审专家会同意资助一个上下游都研究清楚的项目吗？这是大家对国自然申请最大的误解。

试想一下如果某天一觉醒来发现自己中了一个小目标的彩票，然后随便投资了些公司，几个月后小目标就翻了好几倍，你深感赚钱过于轻松容易带来空虚感，于是准备投资科研，这时候摆在你面前的有三个项目：

1、发现A分子很有意思，希望研究它的作用；

2、发现A分子在疾病B中表达显著上调；

3、发现A分子能够通过促进C的表达加剧疾病B进展，并在细胞和动物实验中进行了初步验证

这三个项目都需要你的资助进行研究，那么你会选择哪一个呢？结果显而易见，没有人愿意将钱投入到结果不确定的项目中，因此在立项依据中一定是确定的上下游和作用方式。当然你可以在立项依据末尾写上开放性探索实验，但这个应该建立在主要故事讲清楚、工作量足够的情况下，比如说你研究的是主分子下游通路，那么在最后可以畅想下一个项目会探索主分子上游调控机制等等。

那么上下游都清楚了还有研究的必要吗？当然有！掉入“生物医药坑”之前认为生物实验很有意思，于是立志探索生命的奥秘。真进来了发现科研中其实没几个探索未知的时候，大量的时间和精力都花在验证实验上了。发现表型的内在机制只需要几个实验，证明这一机制却需要几十个不同的实验。实验的多少也反映了投入资金的多少，通常验证过程需要的资金量是探索的2-3倍，这时候就表现出国自然基金的作用了：提供资金充分验证发现的新分子和新机制，促进其落地与转化，这也是国自然申请书中研究方案的主要内容。

这是不是意味着不需要在前期研究基础中进行验证实验呢？当然不是，在立项依据中需要对发现的分子和通路进行初步验证，首先必须得向评审老师证明目标分子/信号通路是存在且起关键作用的，根据实验发现和初步验证实验结果判断是否值得资助。

那么在准备国自然项目时如何平衡立项依据和研究方案中的验证实验内容呢？下面以最简单的线性逻辑介绍一下两者的验证实验设计（见下图）。

1、利用测序数据或前期研究发现主分子A的表达与表型密切，在立项依据中首先需要在临床样本和细胞试验中对A的表达与表型进行验证，如果没有临床样本最好有动物模型样本进行初步验证，细胞中利用A敲除/过表达进行初步的表型验证；而在研究内容里需要更为详细全面的验证，比如扩大数量的临床样本或结合更多临床指标进行相关性分析、在细胞和动物水平利用不同的造模强度验证不同严重程度疾病模型中A的表达变化、同时利用A的抑制剂、敲除或过表达在动物水平验证A在表型中的功能；

2、利用在线互作预测网址找到A的互作蛋白B，在立项依据中需要利用多重免疫荧光在临床病理且片中观察两者的共定位与表型的关系，然后利用Co-IP实验验证两者的相互作用，最后利用A和B的抑制剂/激动剂或敲除/过表达在细胞水平进行挽救实验验证两者功能；而在研究内容里需要更为详细、确凿的实验证明两者存在直接相互作用，比如进行FRET、SPR等分子检测验证互作、线上分子对接预测可能性、质谱检测提供更直接有利的证据并找到互作位点，同时在动物水平利用A和B的抑制剂/激动剂或敲除/过表达在细胞水平进行挽救实验验证两者功能、利用已知的互作位点进行点突变及其对应的挽救实验验证两者互作的功能；

3、确定A和B的相互作用后需要找到一条B的下游信号通路将机制与表型连接起来，在立项依据中需要在临床样本和细胞实验中检测B下游信号通路活性验证上游A和B的改变会导致B下游通路活性改变，进而导致表型的变化；而在在研究内容里需要在动物水平检测B下游信号通路活性随A、B及表型的变化；

4、最后一步是从宏观的角度将A-B-B下游信号-表型串联起来进行上下游和功能验证，立项依据中通常是利用A、B或B下游的抑制剂/激动剂以及基因的敲除与过表达，在细胞模型中设置较为精巧的方式验证整条通路，如果3中已经利用抑制剂或激动剂验证了B下游活性的话也可不在立项依据中进行验证，直接在研究内容里进行细胞和动物的同步验证即可。

以上只是最简单的线性逻辑中的验证实验设计思路，在实际的国自然项目中情况验证实验情况更为复杂，特别是涉及到蛋白的翻译后修饰、细胞间通讯、反馈调节等等，不过万变不离其宗，一般而言立项依据中的验证实验至少要能初步证明科学假说中的相关结论，而研究内容需要对其进行系统性验证。当然前期研究基础越扎实假说的说服力就越强，同样条件下评审专家通过的概率就越高。

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