PBJ | 代谢工程新突破！超表达外源CPL基因明显提高杨树木质素中对羟基苯甲酸酯含量，增加木质素利用价值

木质素是一种复杂的酚类生物聚合物，主要存在于维管植物的次生细胞壁中，是水分传导和植物防御系统的关键组成部分。木质素主要由三种单信号前体组成—对香豆素、松柏素和芥子醇，一旦进入到木质素聚合物中，它们分别成为藻氧基苯基（H）、愈创木基（G）和丁香基（S）木质素单元。因此在自然界中存在着多样的木质素成分和结构。例如，转基因杨树中香豆素酰辅酶A 3'-羟化酶（C3'H）的下调导致H单元水平显著增加，而阿魏酸5-羟化酶（F5H）的过表达产生了一种以S单元为主的聚合物。

在杨树和柳树中，对羟基苯甲酸酯基团（简称为pHB， pHBA：表示游离酸）占木质素的10%，这些来源于单信号醇共轭物，并通过γ位置与木质素结合。由于pHB 基团与木质素聚合物通过酯键连接，它们可以通过温和的碱性水解释放。一旦从生物质中分离出来，这些“cli p-off”酚醛树脂可直接用作平台化学品或升级为各种其他生物化学品和生物产品。虽然木质素的化学复杂性和难降解性对工业生物物质加工提出了重大挑战，但它也为木质素制备各种生化制品和生物制品也铺平了道路。

近日，国际著名期刊Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“Metabolic engineering of p-hydroxybenzoate in poplar lignin”的研究论文。在该研究中作者向转基因杨树中超表达细菌中的丙酮酸酶基因，以产生更多的对羟基苯甲酸盐。通过在细胞质体中特异性地驱动该基因异源表达，使成熟木材中细胞壁结合的对羟基苯甲酸盐增加了50%，并使木质部的发育比对照增加了近10倍。含有对羟基苯甲酸的木质部代谢物的可溶量也保持相当，表明其具有更大的工程化潜力。质谱成像显示，对羟基苯甲酰化升高主要局限于纤维的细胞壁。最后，转基因株系在糖化潜力分析方面优于对照。

作者提供了一种通过增加pHBA前体的供应量来提高pHB水平的新策略。目前已确定pHBA来源于苯丙烷生物合成，然而内源性途径尚未完全阐明，仍然是一个难以达到的工程目标（图1）。但发现细菌进化出了另一种途径：支链磷酸丙酮酸裂解酶（CPL）裂解莽草酸途径的产物，产生pHBA和丙酮酸。已有研究证明使用不同启动子序列将该酶在植物中异源表达，在叶片和植物细胞培养时可检测到各种可溶性pHBA代谢物的积累。由于杨树能够以稳定的形式将pHBA转移到细胞壁上，随后可通过碱性水解释放，因此作者探索了细菌中CPL的异源表达是否会导致杨树木质素的对羟基苯甲酰化增加，从而提供一个容易获得且均匀的pHBA来源。

作者通过农杆菌介导的遗传转化生成转基因杂交杨树系，以评估细菌CPL异源表达的效果。在随机温室试验中，选择五个系与未转化野生型（WT）对照树一起生长18周，进行深入分析。除了生长过程中出现的小幅度减退和分枝现象外，未观察到任何主要的发育缺陷（图2a）。与对照树相比，转基因株系的茎直径短10%，细12%（图2b）。RT-qPCR检测木质部组织中CPL的表达，结果表明Line5的表达量最高。

作者进一步观察了转基因株系中的木质素含量、组成和结构。与WT相比，所有品系中的Klason木质素总含量轻微但显著降低（图3a）。使用硫酰亚胺分解法评估木质素成分是否发生变化。对释放单体的分析表明，除Line1外，所有转基因株系的S木质素单位均显著减少。利用HSQC核磁共振波谱进一步检测木质素的组成和结构变化。酶-木质素制剂的光谱证实了单体组成的微小变化，该分析显示细胞壁结合的pHB基团增加。体积积分显示，与WT相比，Line5成熟木质部中的pHB含量增加了50%。使用凝胶渗透色谱法确定苯甲氧基化的增加是否影响木质素分子量（图3c）。该分析表明，无论是重量（MW）还是数量平均基数（MN），都没有统计学上的显著差异。

接下来，作者分析了转基因株系中对羟基苯甲酸代谢物的积累。由于CPL产生pHBA，这是pHB组的关键前体，因此可以合理预测转基因树中的水平会升高。然而，要转移到细胞壁上，pHBA必须首先转化为苯氧基辅酶A，然后与单信号醇结合，最后输出到质体中木质化位点（图1）。所有转基因株系发育中的木质部所含的游离pHBA明显多于对照组（图5a）。更多的pHBA以不耐碱和不耐酸的形式作为共轭物出现。Line5在木质部发育过程中的代谢产物pHBA总量是对照组的20倍。同时研究发现CPL表达的影响不仅仅限于木质部组织。

尽管CPL杨树中观察到对羟基苯甲酰化的增加，但仍有大量的pHBA未与细胞壁结合，并作为可溶性木质部代谢物积累。本研究首次利用木质化的固有可塑性，以降低杨树的褐变风险。研究果表明，pHBA的酸性糖苷可能被裂解并转移到质外体，可能是随着细胞成熟、细胞死亡并释放其液泡内容物。同时，苯酚代谢产物中的pHB基团的出现突出了细菌CPL在植物体内的有效性，并揭示了这些化合物在杨树木质部生物合成中的巨大可塑性。

用间苯三酚HCl和甲苯胺蓝对茎横截面进行的显微镜分析表明，发现木质部细胞形态和木质素分布没有明显差异。使用二次离子质谱（ToF-SIMS）评估木质部横截面中pHB基团的分布。这项分析表明，pHB基团主要局限于Line5和WT木质部中纤维的细胞壁。针对归一化为S-木质素结构的pHB离子计数计算的指数证实，与WT相比，Line5的纤维含有更多的pHB-基团。当计算维管细胞壁时，Line5的指数再次较高，但由于维管中pHB的弱信号强度，该值较低 (图6)。

同时，作者探讨了将杨树木质素对羟基苯甲酰化的最大化策略。如果要实现真正意义上更高的pHB水平可能需要多管齐下的方法。最近，发现了负责杨树木质素对羟基苯甲酰化的苯氧基苯甲酰辅酶A：单信号转移酶。未来工作的重点是在CPL杨树中过度表达该基因，但还应考虑其他策略，因为单信号酰基转移酶可能无法达到pHBA的预期滴度。同时推测在CPL杨中观察到的对生长的轻微影响可能与对羟基苯甲酰化的增加直接相关。

总之，细菌CPL在转基因杨树中的超表达导致木质素的对羟基苯甲酰化增加，并增强杨树的糖化潜力，同时木质部中pHB基团的分布没有变化。这项工作证明了底物供应在工程细胞壁结合酚类化合物中的重要性。然而，这些转基因杨树中含有丰富的pHBA代谢物也具有开发的潜力。因此，在木质素价值化的背景下，提高pHB基团的丰度值得进一步研究探索，为生产多种生物化学品、生物材料和生物制品提供原料基础。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.13935

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！