Nature Biotechnology | 引导编辑器再升级-直接拆分与逆转录酶筛选

引导编辑器（prime editor，PE）是将nCas9（H840A）与逆转录酶MMLV-RT融合而得的新型基因编辑工具。利用改造后的向导RNA（pegRNAs），PE不仅能实现目标位点四种碱基的自由替换，还能实现碱基的精准插入与删除【1】 （专家点评Nature | David Liu再出重磅基因编辑新工具，可实现碱基随意转换与增删）。已知绝大多数致病遗传变异都是点突变及插入缺失突变【2】，引导编辑器在临床基因治疗研究中具有极大的潜力。为提升PE的编辑效果，研究者对pegRNAs进行了一系列改造【3，4】（Nat Biotechnol | 刘如谦团队改造Prime editing向导RNA（pegRNAs）有效提升精准编辑效率；Cell | 增强Prime Editing基因编辑效果的新思路：细胞内源因子筛选）。此外，研究者还利用双pegRNAs策略提升了PE的碱基编辑效率和精准度【5】（Nat Chem Biol | 伊成器团队开发双pegRNA介导的高效引导编辑系统）。研究者还通过改造PE系统实现了基因组大片段DNA的删除、替换、整合和倒置【6-8】（NBT背靠背 | 薛文/Jay Shendure分别开发删除大片段的基因编辑技术；NBT | Prime editing的改造与新应用—大片段DNA序列的删除、替换、整合和倒置）。不过目前PE系统仍面临多种问题，其中体积过大难以拆分严重阻碍了其应用前景。

2022年9月26日，美国哈佛大学麻省总医院J. Keith Joung实验室与德国慕尼黑工业大学Julian Grünewald合作在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Engineered CRISPR prime editors with compact, untethered reverse transcriptases的论文。文章指出，nCas9与MMLV-RT无需融合，两组分直接拆分表达仍可获得与传统PE功能相近的拆分型PE。此外，研究者还利用直接拆分策略对多种小型逆转录酶进行筛选优化，最终开发出多种新型PE系统，为精准基因编辑提供了新工具。

传统PE系统的融合蛋白长达2117氨基酸，这超出了很多病毒递送系统的包装能力，限制了体内的广泛应用。研究者发现，逆转录酶MMLV-RT融合在nCas9的N末端、C末端以及内部位点均可获得活性及碱基编辑特性类似的PE系统，这提示MMLV-RT可能是作为nCas9的反式作用因子发挥功能。为此研究者尝试将MMLV-RT与nCas9拆分表达以构建新型Split-PE2系统。活性分析发现Split-PE2与传统PE2在多种细胞系中具有类似的活性及编辑特性。此外，Split-PE2的脱靶风险也与传统PE2相近。

传统PE2构建时需要对MMLV-RT与nCas9的融合策略及融合蛋白接头进行优化改造。Split-PE2可避免以上问题，因此更适合对不同类型的逆转录酶进行功能筛选以构建新系统。研究者首先对MMLV-RT的各类截短蛋白进行筛选，发现RNA酶功能域缺失的MMLV-RTΔRH突变体仍保持原有活性，但体积则从2031bp缩减至1488bp。随后研究者对更小体积的7种逆转录酶进行筛选，发现HERV-Kcon-RT与细菌来源II型内含子逆转录酶GsI-IIC-RT 及Marathon-RT具有最明显的编辑活性。之后根据结构信息，研究者还对Marathon-RT进行蛋白质工程改造，发现点突变后的Marathon-RT（D14R-N26R-D74R-N116K-N197R）活性提升了5.2~7.9倍。

随后研究者利用MMLV-RTΔRH与Marathon-RT突变体分别构建了融合版PE和拆分版PE（Split-PE），并在多个内源位点对其活性及编辑特性进行比较分析。结果显示，MMLV-RTΔRH为基础的融合版PE及拆分版PE的编辑活性分别为7.4%~53%和2.3%~46.6%。Marathon-RT突变体为基础的拆分版PE在多个位点的编辑效果优于融合版PE：其中Marathon-RT四点突变构建的拆分版PE编辑活性为0.4%~26.2%；五点突变构建的拆分版PE活性为0.4%~22.7%。

有研究曾利用内含肽策略对传统PE进行拆分并通过双AAV递送系统用于体内编辑研究。研究者对内含肽策略（Split-inteinPE2）和直接拆分策略（Split-PE2ΔRH）在HEK293T细胞中的编辑效率进行比较，发现Split-PE2ΔRH优于Split-inteinPE2。最后研究者还证实，Split-PE2ΔRH可通过双AAV病毒系统进行递送且在U2OS细胞中的编辑效率可达4%。

总体而言，本研究设计的直接拆分策略对PE系统的广泛应用意义重大。直接拆分策略还推动了更多逆转录酶的筛选和新型PE系统的构建，从而为PE的体内应用打下了坚实的基础。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41587-022-01473-1

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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