PBJ | 中国台湾中央研究院生物多样性中心李文雄团队开发在植物组织中同时检测单细胞水平的miRNA以及mRNA新方法

在特定组织中同时检测microRNA（miRNA）以及mRNA可以帮助我们预测miRNA与mRNA之间的调节关系。尽管哺乳动物中已经开发了这类方法，但在单细胞水平的应用层面，其信噪比与分辨率依然较差。为了克服这些缺点，2022年9月23日，来自中国台湾中央研究院生物多样性中心李文雄团队在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了题为“Simultaneous detection of miRNA and mRNA at the single-cell level in plant tissues”的研究论文。在本文中，研究人员开发了一种通过使用序列特异性miRNA-locked nucleic acid （LNA）以及mRNA-LNA探针实现同时检测miRNA与mRNA的方法。这种方法通过滚动扩增增强检测信号，在单细胞水平的应用层面实现高信噪比。基于这种方法，研究人员在水稻、玉米等植物的研究中揭示了miRNA与mRNA的动态表达，该方法是研究miRNA调节植物组织发育的通用技术。

设计miRNA-LNA探针用于原位检测miRNA分子

miRNA-LNA探针的长度为50个碱基，其中5’ 末端的20个碱基完全匹配miRNA序列（图1）。从5’ 端起，第2,4,6,8,10位，分别存在一个LNA修饰位点，形成5’ LNA修饰区，这样既增加了探针的结合强度，又避免了碱基的错误匹配。剩下的部分由30个碱基的独特序列组成，这些序列几乎不存在于目标物种（如水稻和玉米）的转录组中，因此它可以视为带有锁式探针（padlock probe）的杂交模板。锁式探针是一个80碱基组成的5’ 磷酸化核苷酸，由四部分组成，分别是5’ 端的15个碱基序列，3’ 端的15个碱基序列，20个碱基的寡核苷酸结合位点以及30个碱基的骨架片段（图1）。其中3’ 5’ 两端，共30个碱基长的序列将与miRNA-LNA探针的锁式探针杂交位点（Padlock probe hybridization site）相结合（图1）。

同时在组织中检测miRNA与mRNA的原理

利用miRNA-LNA探针检测miRNA的过程主要包括5个步骤（图2左侧）：（1）miRNA-LNA探针与miRNA分子进行杂交；（2）锁式探针与miRNA-LNA，miRNA复合体的杂交；（3）连接锁式探针5’ 端与3’ 端之间的间隙；（4）滚动扩增锁式探针；（5）通过荧光检测扩增序列。

与miRNA-LNA类似，利用mRNA-LNA检测mRNA也需要5个步骤（图2右侧）：（1）mRNA-LNA探针与mRNA分子进行杂交，通过mRNA-LNA引物反转录mRNA，产生cDNA序列；（2）反转录处的cDNA序列可用于设计锁式探针，锁式探针与mRNA-LNA，mRNA复合体的杂交；（3）连接锁式探针5’ 端与3’ 端之间的间隙；（4）滚动扩增锁式探针；（5）通过荧光检测扩增序列。

因此，只需要将含有不同荧光团的寡核苷酸分别与扩增后的寡核苷酸结合位点杂交，就可以在同一组织中同时鉴定miRNA与mRNA了。

在水稻和玉米的叶组织中同时检测miRNA和mRNA分子

为了测试该方法的准确性，研究人员选择了一系列纯合以及杂合的miR156 b/c的突变体水稻，以及miR156 b/cd的过表达水稻作为研究材料（图3）。这一系列材料具有株高的差异，与野生型相比，位点发生突变的材料以及过表达材料都呈现矮化的现象。qRT-PCR的结果显示，伴随植株高度的矮化，水稻叶片内osa-miR156的表达量逐渐升高，而基因OsSPL 12的表达量逐渐降低。利用本文提出的方法对这些材料进行处理，荧光信号的结果与qRT-PCR的结果一致。伴随植株高度的矮化，水稻叶片内osa-miR156的对应的荧光信号增强，而基因OsSPL 12对应的荧光信号减弱。同样的结果在玉米组织的分析中也得到了验证。这说明本文提出的方法可以准确对miRNA及mRNA进行定位与定量。

在本文开发了一种新的方法，通过构建miRNA-LNA探针与mRNA-LNA探针，实现对于同一组织中miRNA与mRNA的同时鉴定，该方法具有高信噪比等优点。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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