华中农大棉花遗传改良团队利用双生病毒滚环复制子元件大幅提升CRISPR/Cas9系统在棉花中的基因编辑效率

棉花（Gossypium hirsutum）是我国最主要的农业经济作物之一，是主要的工业纺织原料和农业榨油原料的来源。在棉花中建立有效的研究基因组学的技术方法，对深入研究棉花功能基因的分子机制具有重大的意义。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对植物基因组进行编辑已经成为研究基因功能的主要手段，在四倍体陆地棉中也已经得到了很好的应用。同时，双生病毒表达载体在植物中也得到了很好的发展及广泛的应用，双生病毒载体能够在侵染植物细胞后以滚环复制的方式产生足够多的供体模板，并且它们在生物体内能够快速复制表达而不随机插入到植物的基因组内，不会对生物体产生毒害作用。利用CRISPR-Cas9结合BeYDV双生病毒复制功能，可以显著提升基因编辑的效率。

近日，华中农业大学棉花遗传改良团队在MDPI 出版社的旗舰杂志Cells（IF=7.66）上发表” Highly efficient genome editing using geminivirus-based CRISPR/Cas9 system in cotton plant”的研究论文。该论文利用菜豆矮缩病毒（BeYDV）滚环复制的功能，结合棉花CRISPR-Cas9基因编辑系统，建立了一套了在棉花中高效的基因编辑敲除系统，并且没有发现脱靶效应。

在本研究中，作者以棉花中的CRISPR-Cas9基因系统为基础载体，结合BeYDV（菜豆矮缩病毒）复制子能够无限复制的功能，建立了能够提高基因编辑效率的敲除载体，为实现在棉花中更高效的基因编辑提供了新的工具。为了验证双生病毒介导的基因编辑载体在棉花中效率，首先，在棉花基因组中验证了绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白RFP两个报告基因在BeYDV双生病毒复制子中的活性，证明了BeYDV双生病毒载体可以在棉花基因组中表达，并且能够提高供体模板浓度；其次，验证了基于双生病毒的CRISPR-Cas9基因编辑系统在棉花基因组的敲除编辑情况。

作者构建了基于双生病毒的CRISPR-Cas9的基因编辑敲除载体，将棉花内源U6.7启动子及靶标序列插入到复制环内，稳定遗传转化棉花后进行检测，发现双生病毒介导的基因编辑载体pBeYDV-Cas9-GhCLA1的编辑效率与pRGEB32-GhU6.7和pRGEB32-35s两种基因编辑载体相比，它们对靶标位点的切割位点是一致的，主要位于PAM位点上游3bp的位置，此外，pBeYDV-Cas9-GhCLA1载体同时对棉花At和Dt亚组的纯合突变编辑效率要比前两种基因编辑载体更高，达到了73.3%，并且相比较pRGEB32-Cas9基因编辑载体，基因突变类型中片段缺失的比例更高，缺失片段的长度也有所增加，同时，缺失片段的长度也有所增加。

作者分析可能是在基因编辑过程中，BeYDV双生病毒复制元件可以提供更多的sgRNA的片段，再有足够活性的Cas9蛋白的作用下，对目标基因的靶位点的切割的频率大大增加，使编辑效率得到了提升。 同时，这种方法并不会改变Cas9蛋白对靶标位点的编辑位点及切割类型，同其他对照载体相同，切割位点主要位于PAM上游的第三个碱基处，同时在这个位置被编辑的频率也是最高的。因此，BeYDV双生病毒介导的pBeYDV-Cas9-KO基因编辑系统在棉花中能够进一步的应用，为基因编辑方法的改良提供一种选择。

图：棉花不同基因组编辑载体编辑效率的比较

综上所述，本研究分别利用CRISPR-Cas9结合BeYDV双生病毒复制功能，优化了在棉花中进行基因敲除的基因编辑载体。因此，植物基因编辑技术的快速发展为作物遗传育种提供了重要的技术手段。利用基因编辑方法实现了高效、精确和有针对性的基因突变，为新的育种策略提供了理论基础和支持。为了开发不同功能的植物基因编辑手段，需要对不同的基因编辑技术进行探索及验证，将优良性状的遗传特征精确的设计到作物育种中。然而，基于基因编辑不能脱离传统育种的其他相关技术，只有与传统育种相结合，才能更好的促进作物遗传育种的发展。

华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室金双侠教授和塔里木大学王彦芹教授为该论文的通讯作者，已毕业博士生李波、硕士生扶春阳及博士生周家伟为共同第一作者，张献龙教授参与指导了这项工作。该研究受到湖北洪山实验室（2021hszd013），Fundamental Research Funds for the Central Universities（2021ZKPY003）和国家自然科学基金（32060109）的支持。

原文链接：

https://www.mdpi.com/2073-4409/11/18/2902/htm

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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