近日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命联合中心王初课题组在Analytical Chemistry杂志上发表题为“Quantifying Turnover Dynamics of Selenoproteome by Isotopic Perturbation”的研究文章。在本项工作中，作者利用同位素扰动策略，并结合化学蛋白质组学技术，发展了一种名为“SElenoprotein Turnover Rate by Isotope Perturbation (SETRIP)”的方法，首次实现了在蛋白质组学水平对硒蛋白动态变化的定量分析，并发现硒蛋白的动态变化存在层级调控的现象。
硒元素作为生命必需的微量元素，与人类健康密切相关。硒元素在体内可以代谢转化为硒代半胱氨酸，进而参与硒蛋白的合成。硒蛋白被认为是生物体内最主要应对氧化应激的一类蛋白，硒蛋白的活性对维持体内氧化还原稳态、胚胎正常发育以及细胞铁死亡调控方面均发挥着重要的生理功能。此前的研究表明硒蛋白的表达和活性状态均受到精确的动态调控。在外源硒被代谢摄入体内时，硒元素会被优先代谢合成某些有重要功能的硒蛋白。当限制外源硒摄入时，体内部分硒蛋白会发生降解以维持组织中重要硒蛋白的表达和活性。此外，在癌症、炎症和神经退行性疾病等疾病过程中以及不同的性别之间，硒蛋白的动态变化也存在明显差异。因此解析硒蛋白在体内的动态变化过程，对深入研究硒蛋白的调控转运和生理功能有着重要的意义。
近年来，针对硒蛋白的组学研究也取得一些进展。利用在酸性条件下硒代半胱氨酸比半胱氨酸有更强亲核性的特点，硒代半胱氨酸可以被碘乙酰胺探针靶向富集和鉴定，从而提高硒蛋白鉴定的灵敏度。此外，课题组之前发展了一种开发的基于硒同位素印记的靶向蛋白组学分析方法SESTAR（号外 | 王初课题组发展基于硒同位素印记的靶向组学分析方法），可以识别复杂蛋白质组环境下质谱信号中的硒同位素印记，随后针对特定的谱峰进行靶向碎裂，大大提升了对硒蛋白鉴定的灵敏度和覆盖度。但是，之前还没有报道可以在蛋白质水平实现对硒蛋白动态变化进行定量分析的方法。
测量蛋白质组动态变化的一种普适方法是利用同位素标记技术。在这个方法中，利用稳定同位素氨基酸(例如，13C和/或15N标记的赖氨酸或精氨酸等氨基酸)通过pulse-chase策略标记细胞培养中的蛋白质，随后利用基于质谱的蛋白质组学对标记蛋白和未标记蛋白的比值进行定量，从而计算出每个蛋白的动态变化速率。但是利用这种方法研究硒蛋白的动态变化时，存在两个难点：一是大部分硒蛋白天然丰度低，难以被经典的鸟枪法蛋白质谱组学鉴定。二是目前没有现存的同位素标记的硒代氨基酸。尽管目前有研究者通过硒同位素（76Se和77Se）标记和电感耦合等离子质谱追踪体内的硒蛋白的动态变化，但是无法在组学水平识别出每一个硒蛋白。基于上述研究背景，我们拟利用74Se代谢标记硒蛋白，并结合化学蛋白质组学技术靶向富集硒蛋白后，发展算法计算硒蛋白中74Se的含量，最后实现在活细胞中对硒蛋白组动态变化的定量分析。
硒元素有六种天然的稳定同位素，因此含硒肽段在一级质谱图上有特殊的同位素分布印记。74Se是硒稳定同位素中丰度最少的一种，因此当硒肽段中的部分硒元素被74Se取代后，74Se同位素信号会明显升高，从而扰动整体的同位素印记分布。考虑到亚硒酸钠能够被细胞代谢利用，作者首先合成了高纯度的Na274SeO3，并通过细胞毒性和细胞累积实验证明了Na274SeO3与正常的亚硒酸钠有相似的生物学性质，且能够被细胞代谢吸收。
为了进一步证明Na274SeO3能够被代谢进入硒蛋白，作者利用Na274SeO3代谢标记细胞后，随后采用化学蛋白质组学策略，分别利用两种探针（偶联生物素的碘乙酰胺探针和课题组之前发展的RSL3-alkyne探针）分别选择性富集细胞中的硒蛋白，并进行质谱鉴定分析。课题组开发的SESTAR++算法（号外 | 王初课题组发展高速识别硒同位素印记的算法）可以在复杂的质谱数据中方便地识别出硒蛋白的同位素印记，进而推测出同位素74Se信号。通过对比Na274SeO3代谢标记细胞前后的质谱信号，可以直观的发现Na274SeO3成功地被代谢进入到硒蛋白的硒代半胱氨酸位点，并且能够对硒蛋白的同位素印记产生时间分辨率的扰动。
在成功观察到Na274SeO3代谢标记能够对硒肽段的同位素印记产生时间分辨率的扰动后，作者开发出一种算法，对74Se取代后的硒肽段的同位素印记进行定量分析，计算出硒肽段中的74Se取代比值。通过对不同74Se取代的硒肽段同位素印记演化的理论模拟，将其与实验中发现的同位素分布进行相似性打分计算，反复迭代后可以求出最相似的74Se取代比例。为了进一步验证算法的可靠性和稳定性，作者将正常硒蛋白质组和74Se完全取代的硒蛋白质组按照预设比例进行混合，该算法计算的实验值与理论值几乎完全匹配，且基本不受蛋白上样量的影响。同时为了进一步提高对硒蛋白质鉴定的数目，作者对化学蛋白质组学流程进行了系统的优化，包括探针、还原剂、酶切和富集的顺序，除盐的方式和蛋白起始量，发现综合使用偶联脱硫生物素的探针以及先酶切富集的策略可以鉴定到最多的硒蛋白。
最后作者结合pulse-chase的策略，分别使用Na2SeO3和Na274SeO3交替代谢标记细胞后，通过优化后的化学蛋白质组学靶向富集硒蛋白，再利用算法计算出不同时间点中硒蛋白组质组中74Se的取代比例，最后成功定量出9个硒蛋白的动态变化速率和半衰期。这9个硒蛋白的半衰期分布在6.0-32.5 h，呈现明显的层级调控的特点。
总之，本工作发展了一种在蛋白质组水平研究硒蛋白的动态变化的新方法，为硒生物学的研究提供了重要工具。本文的通讯作者为北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命联合中心的王初教授。其指导的化学与分子工程学院博士后唐欢（现已入职中国中医科学院青蒿素研究中心）和博士研究生贾国赓为本文的共同第一作者。王初课题组高晋君博士、杨帆博士、博士研究生唐梓耀和刘源博士等合作者为本课题做出了重要的贡献。该工作得到了科技部、基金委、北京分子科学国家研究中心、教育部生物有机和分子工程重点实验室的经费支持。
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.2c00895
文章引用：
DOI: 10.1021/acs.analchem.2c00895
SETRIP下载地址：
https://github.com/wangchulab/SETRIP
PI简历
王初
北京大学化学与分子工程学院教授
北大-清华生命科学联合中心PI
邮箱：
chuwang@pku.edu.cn
实验室主页：
https://www.chem.pku.edu.cn/wangchulab/
研究领域：
化学生物学、蛋白质组学、计算生物学
研究兴趣：
蛋白质是生命功能的主要执行者。在复杂生命体系内系统地发现蛋白质功能位点、精准地探测和调控蛋白质功能变化，具有重要的科学意义，是化学与生命科学交叉研究的核心方向之一。王初课题组致力于综合运用化学生物学、蛋白质谱和理论计算等交叉研究手段，发展和建立了一系列“化学和计算驱动的功能蛋白质组学”新方法，在复杂生命体系内系统生物活性分子在细胞内的分子靶标和修饰位点，探究其生物学功能和作用机制，为精准探测和调控蛋白质功能提供了有力的工具。
代表性研究成果：
1. Yang, F.; Jia, G.; Guo, J.; Liu, Y.; Wang, C.*, Quantitative chemoproteomic profiling with data-independent acquisition-based mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 2022,144 (2), 901-911.
2. Zhang, Y.; Qin, W.; Liu, D.; Liu, Y.; Wang, C.*, Chemoproteomic profiling of itaconations in salmonella. Chem. Sci. 2021, 12 (17), 6059-6063.
3. Qin, W.; Zhang, Y.; Tang, H.; Liu, D.; Chen, Y.; Liu, Y.; Wang, C.*, Chemoproteomic profiling of itaconation by bioorthogonal probes in inflammatory macrophages. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142 (25), 10894-10898.
4. Chen, N.; Liu, Y.; Li, Y.; Wang, C.*, Chemical proteomic profiling of protein 4'-phosphopantetheinylation in mammalian cells. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2020,59 (37), 16069-16075.
5. Qin, W.; Qin, K.; Zhang, Y.; Jia, W.; Chen, Y.; Cheng, B.; Peng, L.; Chen, N.; Liu, Y.; Zhou, W.; Wang, Y. L.; Chen, X.*; Wang, C.*, S-glycosylation-based cysteine profiling reveals regulation of glycolysis by itaconate. Nat. Chem. Biol.2019, 15 (10), 983-991.
6. Wang, J.#; Liu, Y.#; Liu, Y.#; Zheng, S.; Wang, X.; Zhao, J.; Yang, F.; Zhang, G.; Wang, C.*; Chen, P. R.*, Time-resolved protein activation by proximal decaging in living systems. Nature 2019, 569 (7757), 509-513.
7. Gao, J.#; Yang, F.#; Che, J.; Han, Y.; Wang, Y.; Chen, N.; Bak, W., D.; Lai, S.; Xie, X.; Weerapana, E.; Wang, C.*, Selenium-encoded isotopic signature targeted profiling. ACS Cent Sci.2018, 4 (8), 960-970.
8. Dai, J.; Liang, K.; Zhao, S.; Jia, W.; Liu, Y.; Wu, H.; Lv, J.; Cao, C.; Chen, T.; Zhuang, S.; Hou, X.; Zhou, S.; Zhang, X.; Chen, X. W.; Huang, Y.; Xiao, R. P.; Wang, Y. L.; Luo, T.; Xiao, J.; Wang, C.*, Chemoproteomics reveals baicalin activates hepatic CPT1 to ameliorate diet-induced obesity and hepatic steatosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018,115 (26), E5896-E5905.
9. Chen, Y.; Liu, Y.; Lan, T.; Qin, W.; Zhu, Y.; Qin, K.; Gao, J.; Wang, H.; Hou, X.; Chen, N.; Friedmann Angeli, J. P.; Conrad, M.; Wang, C.*, Quantitative profiling of protein carbonylations in ferroptosis by an aniline-derived probe. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140 (13), 4712-4720.
10. Chen, Y.#; Qin, W.#;Wang, C.*, Functional proteomics driven by chemical and computational approaches. Chinese Journal of Chemistry 2022, 40 (5), 628-634.
文章来源公众号王初课题组
转自：生命科学联合中心
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