以下文章来源于Mol Plant植物科学 ，作者PengCheng Wei
标记蛋白质是研究基因功能的重要手段。在植物基因组上定点插入蛋白标签序列是体内标记目的基因的理想方法。同源重组、Cre-LoxP和FLP-FRT等位点特异性重组酶(SSR)系统等均可在植物内实现基因或片段的定点插入，但存在效率偏低、操作复杂等问题。因此，需要开发高效易用标签序列定点插入方法。
近日，魏鹏程团队在Plant communications在线发表了 “Prime editing-mediated precise knock-in of protein tag sequences in the rice genome”的研究论文https://doi.org/10.1016/j.xplc.2023.100572[1]。该工作通过升级引导编辑器及采用GRAND editing策略，在水稻基因组中有效插入HIS、HA和FLAG等蛋白标签序列。
引导编辑技术（Prime editing）是一种基于CRISPR/Cas系统的精确基因组编辑技术，可灵活地在作物中实现碱基替换、片段缺失和插入等多种类型的精准变异，但早期版本的片段插入效率较低。研究团队前期通过工具迭代，获得了高效的引导编辑器enpPE2[2]。本研究中，首先利用enpPE2系统在基因OsUBQ10和OsTubA1终止密码子上游9 bp位点和12bp位点分别插入了6XHis和HA标签序列，在10.42% ~ 43.75%的转基因植株中实现了标签序列插入。为了进一步提高标签序列插入频率，研究组根据高彩霞研究员团队的前期报道[3]，在去除enpPE2中M-MLV逆转录酶的RNase H结构域的同时引入N端融合病毒核衣壳蛋白（NC），升级为ePE2工具。与enpPE2相比，ePE2在标签插入效率上提高了1.90倍，且15.63%和5.21%的转基因植株中分别含有6XHis和HA的纯合插入。
虽然ePE2可以精确地在水稻基因上插入短序列标签，但对较长的3XFLAG序列插入活性有限。为了提高标签插入频率，研究组根据武汉大学殷昊团队开发的GRAND editing策略[4]，设计两条互补RTT的pegRNA敲入标签序列。当RTT互补序列为40bp时， 25%的转基因水稻株系中检测到了3XFLAG标签的定点插入。进一步结果表明，在植物中定点插入的标签可以被Western印记检测。
该论文报道了简单可靠的水稻标签敲入基因标记系统，这也是该团队第四篇关于植物引导编辑的报道 [1, 2, 5, 6]。研究内容由安徽省农业科学院和安徽农业大学合作完成，得到了国家重点研发计划、自然科学基金等项目资助。
参考文献：
1. Li J, Ding J, Zhu J, Xu R, Gu D, Liu X, Liang J, Qiu C, Wang H, Li M, et al: Prime editing-mediated precise knock-in of protein tag sequences in the rice genome. Plant Communications 2023:100572.
2. Li J, Chen L, Liang J, Xu R, Jiang Y, Li Y, Ding J, Li M, Qin R, Wei P: Development of a highly efficient prime editor 2 system in plants. Genome Biology 2022, 23:161.
3. Zong Y, Liu Y, Xue C, Li B, Li X, Wang Y, Li J, Liu G, Huang X, Cao X, Gao C: An engineered prime editor with enhanced editing efficiency in plants. Nature Biotechnology 2022, 40:1394-1402.
4. Wang J, He Z, Wang G, Zhang R, Duan J, Gao P, Lei X, Qiu H, Zhang C, Zhang Y, Yin H: Efficient targeted insertion of large DNA fragments without DNA donors. Nature Methods 2022, 19:331-340.
5. Xu R, Li J, Liu X, Shan T, Qin R, Wei P: Development of Plant Prime-Editing Systems for Precise Genome Editing. Plant Communications 2020, 1:100043.
6. Xu R, Liu X, Li J, Qin R, Wei P: Identification of herbicide resistance OsACC1 mutations via in planta prime-editing-library screening in rice. Nature Plants 2021, 7:888-892.
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
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