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导读
小建中汤（XJZ）作为一种经典的中药，对慢性萎缩性胃炎（CAG）有很好的治疗作用。然而，XJZ的药理机制尚未得到充分解释。本研究旨在采用多组学方法，通过肠道微生物组研究XJZ对CAG大鼠的作用机制；通过整合基于超高性能液相色谱串联四极飞行时间质谱（UHPLC-QTOF-MS）的非靶向代谢组学方法和16S rRNA基因测序，分析大鼠盲肠内容物。最后，我们通过分子对接验证了差异代谢产物与胆汁酸（BA）相关靶标的相互作用。基于VIP、|log2（FC）|、-ln（p值）和ǀp（corr）ǀ的综合评价，我们采用了一种新的策略来筛选差异代谢物。结果发现，XJZ对筛选的代谢产物胆酸、脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、二十二碳六烯酸和L-异亮氨酸显示出有益调节。16S rRNA基因测序分析表明，XJZ可以调节CAG大鼠的肠道微生物群紊乱，尤其是胆汁酸（BA）代谢相关细菌（Butyricimonas、脱硫弧菌、拟杆菌、Parabacteroides、醋酸杆菌和另枝菌）。分子对接进一步表明，XJZ调控的差异代谢产物对BA相关靶点具有良好的对接作用。目前的研究表明，XJZ的治疗作用与BA相关的微生物和代谢过程密切相关。这些发现为XJZ治疗CAG的效果提供了新的见解。
论文ID
原名：Bile acid metabolism involved into the therapeutic action of Xiaojianzhong Tang via gut microbiota to treat chronic atrophic gastritis in rats
译名：小建中汤经肠道菌群作用于慢性萎缩性胃炎大鼠的胆汁酸代谢
期刊：Phytomedicine
IF：6.656
发表时间：2022.11
通讯作者：秦雪梅，刘月涛
通讯作者单位：山西大学中医药现代研究中心
【期刊简介】
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实验结果
1. UPLC和UPLC-Q-Exactive-MS条件下XJZ的定性检测
混合物的UPLC图谱见图2。六种化学参考标准品的定量见表2。液相色谱条件方法验证的详细信息见补充材料。XJZ的化学成分分析使用超高性能液相色谱-质谱（UPLC-Q-Exactive-MS）进行了表征，其中鉴定了53种化合物。表S1-S2总结了详细的化合物信息，相关色谱图如图S1所示。
表1 XJZ的成分表
2. 药效学评价
2.1 外观状态和重量
对照组大鼠生理功能正常。随着造模期进行，模型大鼠的皮毛变黄。对照组和模型组之间的大鼠体重差距逐渐扩大（图3B）。XJZ和替普瑞酮处理后，上述症状均有一定程度的缓解。
表2 用UPLC对XJZ的色谱数据进行分析
P：芍药；G：甘草；Z：姜
2.2 组织病理分析
苏木精-伊红染色结果如图3A所示。对照组胃粘膜细胞排列整齐，腺体形态正常。模型组大鼠胃粘膜有嗜酸性粒细胞浸润，腺体萎缩，可推断为CAG。XJZ处理后大鼠胃肠粘膜损伤有一定程度的改善。
图1 筛选差异代谢物的综合策略
图2 标准品(A)和XJZ (B)的UPLC色谱图
2.3 胃液pH值和胃蛋白酶检测结果
模型组胃液的pH值显著高于对照组（p<0.01，图3C）。模型组的胃蛋白酶活性显著低于对照组（p<0.01，图3D）。XJZ对胃液pH值和胃蛋白酶活性有良好的调节作用。
图3 （A）苏木精-伊红染色结果。（B）大鼠体重变化曲线。（C）胃液pH值测试结果。（D）胃液胃蛋白酶活性试验结果。与对照组相比，***p＜0.001；与模型组相比，###p＜0.001。
表3 VIP、|log2(FC)|、ǀp(corr)|和-ln(p-value) 11种组合的结果
3. 盲肠内容物代谢组学研究
3.1 LC-MS分析的适用性
代谢组学样品的总离子色谱图（TIC）如补充材料图S2所示。表S3和图S3显示了六个QC样品重复性结果测试。我们对QC样品进行PCA分析，以监测其稳定性和重复性。如图S4所示，所有QC样品均在两个标准差（2SD）内，表明该方法适用于本研究。
图4 （A）正离子模式的PLS-DA评分图（R2X=0.505，R2Y=0.949，Q2=0.839）。（B）负离子模式的PLS-DA评分图（R2X=0.549，R2Y=0.974，Q2=0915）。（C）VIP、|log2（FC）|、-ln（p值）和|p（corr）ǀ的回归曲线。（D）VIP、|log2（FC）|、-ln（p值）和|p（corr）|的R2X、R2Y和Q2的趋势。（E）四个因素被排列成11个组合，最佳组合的比例通过Venn图显示（F）使用PLS-DA模型对上一步骤中获得的最佳组合进行置换检验。
表4 8个相关对显示了XJZ对代谢产物和肠道菌群的调节作用
CA：胆酸；GUDCA：甘氨熊去氧胆酸；TCDCA：牛磺酸脱氧胆酸；DCA：脱氧胆酸；DHA：二十二碳六烯酸；LI：L-异亮氨酸
3.2 盲肠内容物的代谢谱分析
代谢组学数据用于提取1157个负离子特征和1062个正离子特征。我们筛选了CV≤30%和α<0.05的PLS-DA变量，其中负离子变量584个，正离子变量492个。对照组和模型组可以在正离子模式和负离子模式中明显分离，如图4A和B所示。XJZ组分散在它们之间，表明药物干预对CAG引起的代谢紊乱具有调节作用。
3.3 盲肠内容物差异代谢物的筛选与分析
在负离子和正离子模式中，有584和492个变量被选为初始变量（N0）。以负离子模式为例解释分析细节。首先，我们计算了a、b、c和d的单因素筛选变量。回归曲线如图4C所示。回归方程如下：
������/���0 = ������(���) = ���−1.728x ���2 = 0.9878 (1a)
������/���0 = ������(���) = 0.0033���5 − 0.061���4 + 0.3493���3 − 0.6857���2 − 0.0765��� + 1.2 ���2 = 0.9783 (2a)
������/���0 = ������(���) = 3.1656���−0.289x ���2 = 0.9815 (3a)
������/���0 = ������(���) = −1.766������(���) − 0.1698 ���2 = 0.9943 (4a)。
该回归方程的R2均高于0.95，表明这些方程准确地反映了Na/N0、Nb/N0、Nc/N0和Nd/N0的变化。最大值计算为：amax=2.67，bmax=4.14，cmax=18.94，dmax=0.90。
R2X、R2Y和Q2的趋势如图4D所示。我们共设置了5个阈值，与特定阈值相对应的变量数量如表S4所示。以VIP为例，可以看出，随着值的增加，R2X呈上升趋势，而R2Y和Q2均呈下降趋势。当VIP=2.2525时，R2X和R2Y、Q2相加得到最大和值。因此，a=2.2525被视为VIP的最佳阈值。同样，我们选择b、c和d的最佳阈值分别设置为2.57、18.936和0.58。
图5 实验组5种生物标志物的相对变化
与对照组相比，***p＜0.001；与模型组比较，p＜0.01，p＜0.001。
之后，我们将前一步骤中获得的变量与多个因素相结合，以筛选差异代谢物。Venn图显示了满足多种因素要求的变量数量，如图4E所示。我们总结了表3中的所有组合类型，其中集合1和集合8；集合4和集合10分别相同。然后我们对这些组合执行PLS-DA。R2X、R2Y和Q2的最高值分布在不同的组合中。因此，我们计算了三个值的总和，以全面评估PLS-DA模型。结果，组合5获得了最高的分数。因此，组合5中的变量是预期的差异代谢物。此外，我们检验了组合5的PLS-DA模型，并证明其有效（图4F）。
基于该数据库，我们筛选出5种负离子模式下检测到的代谢物，并在负离子模式中鉴定为L-异亮氨酸、胆酸（CA）、甘氨熊脱氧胆酸（GUDCA）、牛磺脱氧胆酸（TCDCA）和脱氧胆酸（DCA）。同样，二十二碳六烯酸（DHA）被选择并鉴定为正离子模式下的差异代谢物。这些代谢物的综合信息记录在表S5中。
图6 使用MetScape插件获得的差异代谢物的化合物-反应-酶-靶点网络。
3.4 XJZ对CAG大鼠差异代谢物的调节作用
我们使用差异代谢物相对含量的方差分析来探索XJZ对CAG的调节作用（图5）。与对照组相比，模型组这些差异代谢物显著增加。XJZ给药显著发挥了对其异常的有利调节作用。
图7 两个步骤中前三名得分的分子对接
（A-C）不同代谢物及其预期靶点的对接结果。（D-F）差异代谢产物和BAs的靶点的对接结果。
4. 分子对接
为了更全面地了解XJZ改善CAG的机制，我们基于上述代谢组学构建了一个相互作用网络，如图6所示。我们将差异代谢物导入Cytoscape中的MetScape插件，以收集化合物-反应-酶-基因网络，其中获得了13个代谢产物相关靶点（ACOT1、ACOT2、ACOT4、ACOT6、ACOT7、ACOT8、BAAT、BCAT、BCAT2、IARS、IARS2、IL4I1和SLC27A5）。表S6显示了每个对接靶点的数据源和对接盒以及完整的对接结果。第一步对接结果中能量低于-4.25 kcal/mol、-5 kcal/mol和-7 kcal/mol的对接比例分别为91%、70%和40%，表明差异代谢物与其预期靶点具有良好的相互作用。如表S7所示，BA代谢物在这些结果中的表现优于其他代谢物。类似地，在第二步中，不同的代谢产物与我们选择的BA相关靶点很好地相关。对于相互作用，如表S8所示，100、95和50%的对接能量分别小于-4.25 kcal/mol、-5 kcal/mol和-7 kcal/mol。两个步骤中排名前三的分子对接结果如图7所示。
图8 （A）不同分类水平下每个样本的OTU数量统计。（B）每组的PCoA分析。（C）通过Spearman相关分析筛选出八个强相关对（|r|>0.8）。（D）78对具有强相关性（|r|>0.5）的代谢产物肠道微生物群相关对的spearman相关分析热图。
5. 16S rRNA测序结果
5.1 细菌组成及多样性分析
表S9和图8A显示了不同分类水平下每个样本的OTU数量统计。以直方图的形式显示不同样本在每个分类水平上的单元数。结果表明，与对照组相比，模型组在门、纲和目水平上的OTU降低，并且在XJZ给药后有一定程度的调整。同时，这一变化在科水平并不明确。然而，属和种水平的OTU增加，并且在给药后存在一定程度的调节。
α多样性分析如图S5所示。与对照组相比，模型组显示出增加的丰度。基于Beta多样性分析的PCoA显示，对照组和模型组可以完全分离，XJZ组位于两者之间，表明XJZ对CAG大鼠的肠道微生物群有中等影响（图8B）。
门水平微生物群组成如图S6所示。研究发现，与对照组相比，模型组的5个门水平的丰度发生了显著变化。其中，给药后对p_Tenericute和p_[Termi]门的调节作用最明显，但对其他门没有明显的改善。科水平微生物群组成如图S7所示。模型组10个科的丰度异常。XJZ处理后，f_Acetobacteraceae和f_Enterobacteriaceae的丰度显著调整。在属水平上，如图S8所示，与对照组相比，模型组中有15个属发生了显著变化。给药后，醋酸杆菌、脱硫弧菌和g_Clostridium三个属的丰度可显著恢复。
6. 代谢组学与16S rRNA测序结果的相关性分析
通过Spearman相关性分析，我们筛选出78对具有强相关性（|r|>0.5）的代谢产物肠道微生物群相关对，如表S10和图8D所示。大多数代谢产物主要与醋杆菌、拟杆菌、Butyricimonas、脱硫弧菌、Parabacteroides和另枝菌呈负相关。如图8C所示，我们获得了8个强相关对（|r|>0.8），即GUDCA与Butyricimonas、L-异亮氨酸与脱硫弧菌、TCDCA与拟杆菌、DCA与Parabacteroides、DCA与 Butyricimonas、DHA与脱硫弧菌，DCA与醋杆菌以及DCA与另枝菌。这些相关的配对可能揭示了CAG发病机制中意想不到的见解。XJZ对这些强相关对的总体调节作用如表4所示，这是基于对代谢产物和肠道微生物群的显著分析而描述的。
讨论
我们采用UHPLC-QTOF-MS分析盲肠内容物的代谢特征，揭示了肠道微生物群在XJZ改善CAG中的重要作用。通过比较对照组和模型组之间的VIP、-In（p值）、|log2（FC）|和ǀp（corr）|四个指标的组合，我们筛选出CA、TCDCA、GUDCA、DHA、DCA和L-异亮氨酸作为差异代谢物。通过这四种指标的组合确定的代谢产物可以更准确地指示CAG代谢谱的变化。CA、TCDCA、GUDCA和DCA均属于BA代谢产物，由肝脏中的胆固醇合成，然后由肠道微生物群修饰。它们在模型组中显著增加，这表明BA代谢可能是与CAG相关的关键途径。这一结果也与之前的其他报道相吻合，其中肠内BAs的代谢紊乱是由灌胃给予脱氧胆酸钠引起的。
ACOT1、ACOT2、ACOT4、ACOT6、ACOT7、ACOT8、BAAT和SLC27A5参与BA生物合成，而BCAT、BCAT2、IARS、IARS2和IL4I1参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解。在不同代谢物与这些靶点的对接结果中，GUDCA、DCA、TCDCA和CA的平均得分分别为-7.3 kcal/mol、-7.1 kcal/mol和-6.9 kcal/mol。DHA和L-异亮氨酸的得分分别为-6.3 kcal/mol和-4.5 kcal/mol。这表明BA代谢产物可能在CAG代谢过程中发挥重要作用。
我们通过16S rRNA测序技术筛选出了Butyricimonas、脱硫弧菌、拟杆菌、Parabacteroides、醋酸杆菌和另枝菌。随后的相关分析表明，差异代谢产物和肠道微生物群密切相关。
初级BAs可通过MAPK信号通路激活胃癌中Egr-1的表达，其在胃中的浓度升高与早期胃癌相关。DCA是肠道微生物群代谢的次级BAs。模型组DCA含量显著增加。它与Parabacteroides和醋杆菌的丰度呈正相关，但与Butyricimonas和另枝菌呈负相关。因此可以推断CAG与Parabacteroides和醋杆菌介导的BA代谢失调有关，而XJZ可以通过作用于Butyricimonas和另枝菌来改善CAG的BA代谢。
TCDCA具有重要的抗炎作用。拟杆菌是肠道中的一种有益细菌。研究表明，拟杆菌具有BA代谢的功能。TCDCA的增加有利于拟杆菌丰度的增加。相关分析表明，TCDCA与拟杆菌显著正相关。
GUDCA和Butyricimonas表现出显著正相关。GUDCA是一种法尼醇X受体（FXR）拮抗剂。GUDCA是一种法尼醇X受体（FXR）拮抗剂。FXR受体的表达是BA合成的负反馈。GUDCA与FXR的对接分数为-7.9 kcal/mol，表明其具有BA调节作用。Butyricimonas可以产生丁酸盐，丁酸盐可以促进肠道中有益菌的生长，以平衡肠道微生物群。丁酸产生菌的减少与炎症显著相关。增加丁酸的摄入可以调节BA代谢并减少炎症。因此，我们推测XJZ可能通过增加Butyricimonas等丁酸合成相关菌的表达来降低GUDCA，从而减弱GUDCA对FXR的抑制作用，抑制肝脏BAs的合成，以消除炎症。
DHA是一种omega-3多不饱和脂肪酸。脱硫弧菌是肠道中的一种有害菌。脱硫弧菌的增加与代谢紊乱和炎症有关。硫酸盐还原脱硫弧菌可代谢硫酸盐产生H2S，这可能通过激活FXR和抑制CYP7A1来影响肝脏BA代谢。DHA可以显著降低脱硫弧菌的含量，减少肠内BA的再摄取。模型组DHA显著增加，XJZ处理后DHA水平显著回调。L-异亮氨酸在免疫功能中起重要作用。相关分析表明，L-异亮氨酸与脱硫弧菌呈正相关。这表明L-异亮氨酸可能在调节脱硫弧菌中发挥潜在作用。
我们选择了七个BA相关靶点，以进一步确定BAs对XJZ疗效的影响。CYP7A1是BAs经典合成途径中的限速酶。FXR在负反馈中抑制CYP7A1的表达。SHP通过与LRH-1相互作用抑制CYP7A1的表达。肝脏中产生的胆酸盐通过肝细胞表面的BSEP运输到胆小管，并储存在胆囊中。BAs作为TGR5的配体在能量代谢中发挥重要作用。BAs被肠上皮细胞吸收后，IBABP结合并运输到基底外侧膜。七个靶点的平均对接得分均低于-5 kcal/mol。SHP、CYP7A1和TGR5的平均对接得分均低于-7kcal/mol。这表明我们筛选的差异代谢产物与BA靶点具有良好的相互作用，XJZ可以通过调节BA代谢在CAG治疗中发挥作用。
总之，我们的工作全面评估了XJZ的疗效。结果表明，肠道微生物群对BA代谢的调节是影响XJZ治疗效果的关键因素。然而，仍有许多缺点需要克服。尽管这些代谢物和微生物可以用作治疗靶点。潜在的生化机制仍不清楚。分子对接的结果需要进一步验证。药物成分与肠道微生物群之间的关系需要通过体外肠道微生物群培养实验进一步验证。此外，16S rRNA筛选的与CAG相关的差异肠道微生物群的功能尚不清楚，需要通过宏基因组学方法进行研究。
结论
本研究结合代谢组学、分子对接和16S rRNA技术，研究肠道菌群在XJZ治疗CAG大鼠中的作用。首先，我们利用代谢组学和独特的差异代谢物筛选策略，发现BA代谢在XJZ疗效中起着关键作用。其次，我们应用分子对接来验证不同代谢产物与BA相关靶点之间的关系。最后，16S rRNA技术进一步说明了XJZ对肠道微生物群生物多样性的调节，这与代谢紊乱密切相关。CA、DCA、GUDCA、TCDCA这四个BAs是我们的重点。Butyricimonas、脱硫弧菌、拟杆菌、Parabacteroides、醋酸杆菌和另枝菌与这些BA代谢密切相关。通过调节这些属，可以影响BA代谢，并在CAG的治疗中发挥作用。该工作对XJZ的临床用药具有一定的指导作用。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36610165/
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