背景
肝细胞癌 (HCC)是世界范围内的常见癌症，其5年生存率仅为18%。肝细胞癌切除术后的高复发率 (5年复发率高达70%)是影响患者长期生存的一个重要障碍。更好地了解复发性肝癌的肿瘤免疫微环境 (TIME)对于在这种侵袭性疾病的早期阶段制定个性化治疗策略至关重要。因此，本研究旨在揭示真实与新发肝细胞癌 (HCC)复发中的单细胞免疫生态系统有助于优化免疫治疗的发展。
简介
2023年1月3日，来自中国中山大学第一附属医院的Ming Kuang及其团队在Gut (IF: 31.795)杂志上发表名为Distinct single-cell immune ecosystems distinguish true and de novo HBV-related hepatocellular carcinoma recurrences的研究[1]。
研究亮点
1、真正复发性病灶是在原发性肿瘤诊断前种植的，新发癌症可能比临床使用的2年期限更早发生。
2、ScRNA测序结果揭示了乙型肝炎病毒 (HBV)相关HCC真正复发和新发复发中的不同免疫生态系统，强调了两种类型HCC复发需要不同的免疫治疗策略。
3、肿瘤特异性CD8+ T细胞在在新发复发中表现出细胞毒性和耗竭表型，而在真正复发的病灶中，肿瘤特异性CD8+ T细胞表现出细胞毒性弱的记忆表型。
4、仅在真正复发的病灶中，在树突状细胞附近才能检测到表达抑制性分子GDF15的肝癌细胞；GDF15表达水平与预后较差相关。
5、这份全面的复发性HCC病sc转录组图谱是研究和指导复发性HCCs的个体化免疫治疗并为其开发提供信息的资源。
6、GDF15是真正复发性HCC病免疫治疗的潜在生物标志物和靶点。
7、对于正在接受治疗性治疗以防止疾病复发的HCC患者，在临床诊断和围手术期治疗中应考虑在HCC发生早于预期的真实和新发复发。
主要结果
我们从20例未经治疗的复发性HCC患者 (发现队列)中采集了23份肿瘤样本和11对非肿瘤性邻近肝组织 (NAT)，并进行了5 '和VDJ scRNA-seq分析 (图1A)。在该队列中，我们还使用了来自WES的原发性肿瘤、NAT和复发性肿瘤的匹配组织标本，以确认复发类型，并使用bulk RNA-seq来验证scRNA-seq分析的结果。此外，我们还纳入了WES和bulk RNA-seq的验证队列1 (26例患者，具有原发性和复发性HCC的配对手术样本)和验证队列2 (47例患者，具有WES和IF的配对原发性和复发性手术样本) (图1B)。在所有三个队列中比较了真实复发与新发复发患者的基线特征。临床随访于2022年1月31日截尾。
图1. 研究工作流程和基因组分析确定了具有不同突变特征和进化轨迹的新发HCC与真实复发HCC
scRNAseq对两种复发性HCC的TIME分析
为了比较真正复发和新发复发HCC的时间，我们对23例复发肿瘤样本和11例NAT样本进行了5 '和VDJ scRNA-seq分析。经过质和筛选，共获得317558个高质量细胞，平均检测基因1648个。然后，我们使用Seurat V.4.0进行了细胞分类和标记基因鉴定，并使用Umap检测并可视化了4个主要簇 (图3A)。我们进一步将每个主要细胞划分为亚群，以生成复发性HCC的整体细胞图谱，结果显示总共有43种细胞亚型 (图3B)。以ALB、TTR、APOA2为标记物鉴定恶性细胞；非免疫基质细胞包括使用标记物ACTA2和PDGFRB鉴定的肝星状细胞 (HSCs)和定义为PECAM1和CDH5表达细胞的内皮细胞 (ECs) (图3A)。不出所料，恶性细胞占非免疫细胞的大部分，而HSC和ECs仅占较小的比例 (28.33%) (图3A)。通过检测由scRNA-seq数据推断的拷贝数变异来确认肿瘤的起源。另一方面，浸润的免疫细胞包括T细胞/固有淋巴样细胞 (ILCs) (CD3D/E, TYROBP)、髓样细胞 (CD68和LYZ)、中性粒细胞 (CSF3R)、浆细胞样树突状细胞 (pDCs) (LILRA4和IL3RA)、B细胞 (MS4A1和CD79A)、浆细胞 (MZB1和免疫球蛋白)和肥大细胞 (CPA3) (图3A、B)。这些免疫细胞亚型以相对相似的比例存在于所有复发性HCC样本中 (图3C)。接下来，我们对髓样和淋巴样细胞群进行了无监督聚类。
图3. 复发性HCC免疫微环境的ScRNA-seq图谱
免疫抑制检查点GDF15在真正复发肿瘤的HCC细胞中上调
为了进一步了解真正复发的HCC的免疫逃逸，我们评估了既往报道的介导免疫逃逸的免疫检查点分子的表达水平。免疫检查点基因PDCD1LG2、CD274、CTLA4、VTCN1在肝癌细胞中低表达。
为了证明GDF15对DC和CD8+ T细胞功能的抑制作用，我们进行了体外功能实验。将DCs和CD8+ T细胞与单独的重组GDF15、GDF15和抗GDF15中和抗体或GDF15和同型匹配抗体共培养。我们发现，在GDF15处理组中，DC抗原呈递过程中至关重要的共刺激分子CD40、CD80和CD86的蛋白水平显著下调，使用抗GDF15中和抗体可以部分恢复这一效应 (图7A-C)。同样，GDF15处理组的GZMB+CD8+ T细胞比例显著降低，相反，抗GDF15中和抗体增加了GZMB+CD8+ T细胞比例 (图7D)。这些发现表明，GDF15可抑制DC的抗原提呈和CD8+ T细胞的细胞毒性能力，这与GDF15的影响一致，即在真正复发的HCC中，肿瘤特异性CD8+ T细胞和DC之间的相互作用低于原发HCC (图7E)。
图7. GDF15的免疫抑制作用及其在复发性HCC中的预后价值
结论及展望
总而言之，我们的结果揭示了新发和真正复发HCC的不同时间。区别包括不同的免疫和恶性细胞表型，T细胞发育轨迹，TCR克隆性，转录组学特征和细胞间相互作用。我们的研究主要包括HBV相关的HCC，因此有必要在其他病因的HCC中进行类似的比较研究。在基于基因组学和时间的患者分层的指导下，我们的研究结果可能对正在进行的在HCC围手术期实施基于免疫疗法的方法具有直接的临床意义，并支持对抗PD-1治疗新发复发以及抗GDF15治疗和/或DC疫苗在HBV相关HCC真正复发中的进一步测试。
原文链接
https://gut.bmj.com/content/early/2023/01/03/gutjnl-2022-328428
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