背景：
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)及其炎症形式非酒精性脂肪性肝炎(NASH)已迅速上升，成为西方世界最常见的慢性肝病，并且是肝细胞癌(HCC)发展的危险因素。HCC不仅是最常见的恶性肿瘤之一，而且具有高度的致死率。然而，目前尚无临床批准的治疗NAFLD的药物，而NASH诱发的HCC构成了独特的代谢微环境，可能影响对某些治疗的应答。因此，迫切需要更好地了解这种猖獗疾病的发病机制，以设计新的治疗方法。在这方面，临床前小鼠模型是研究NASH发病机制和新的治疗模式的关键工具，为人类临床试验做准备。虽然有许多遗传、饮食和毒素诱导的NASH模型，但并不是所有的模型都能很好地反映人类的病理。
简介：
2022年12月，来自德国癌症研究中心(DKFZ)慢性炎症和癌症部的Mathias Heikenwalder教授课题组在Nat Metab（IF: 19.8）杂志上发表题为“A researcher's guide to preclinical mouse NASH models”的文章[1]。在这篇文章中，作者介绍了目前应用最广泛的NASH小鼠模型，并强调了各种模型的一些主要优点和缺点，重点强调了“西方饮食”，这些模型越来越多地被认为是反映人类NASH病理和合并症的最佳模型。
主要结果：
NASH和NASH-HCC的小鼠模型。
过去10年间，NASH研究迅速增加，NASH和NASH - HCC临床前小鼠模型的开发也随之增加。这些模型不仅在肝损伤的主要来源(饮食、遗传和/或毒素)方面有很大差异，而且在发病时长、性别外显率(雄性往往具有较高的外显率)和应使用的小鼠年龄(较年轻的小鼠更容易受到损伤)方面也有很大差异。此外，还必须考虑其他重要参数，如微生物组、小鼠饲养条件、组织病理学分析的一致性和最近描述的混杂因素，如在C57BL/6小鼠中观察到的自发性胆碱血症以及来自特定供体的近交系菌株的遗传漂变(例如，C3H/HeJ小鼠携带影响Toll样受体4信号传导的自发突变)。
NASH和NASH - HCC的饮食模型。
饮食诱导的肥胖是驱动人类NAFLD和NASH的最大危险因素之一，即使考虑了年龄、性别和高血压等混杂因素。NASH是一个高度复杂的过程，涉及肠道、肠道菌群、各种代谢器官(如胰腺、脂肪组织和骨骼肌)和免疫系统。因此，基于饮食的NASH临床前模型被认为是最适合的模型，可以忠实地反映和表型反映人类病理及其随时间推移的动态，而且它们还允许研究者在全身和局部水平分析疾病过程。多年来，有许多基于饮食的NAFLD/ NASH模型，但在这里，我们将深入研究一些最广泛使用的模型，强调西方饮食和营养缺乏饮食的不同“特点”，并讨论每种饮食可能最适合哪种情况。
西方饮食被广泛用于NASH的研究。
所谓的“西方饮食”包括高脂肪/高碳水化合物(HF-HC)饮食在过去的几十年里已经成为西方社会的主要饮食。最近的一项系统综述评估了4,540篇利用各种NAFLD动物模型的文章，发现高脂/高果糖饮食与人类NAFLD最为相似。虽然不同市售饮食(即脂肪、糖和胆固醇的组成)之间的确切配方可能不同，但人们普遍认为，在研究肥胖和代谢综合征状态下饮食诱导的NASH和NASH- HCC转变时，这些饮食代表了最具转化相关性的模型。
胆碱缺乏的NASH和NASH - HCC高脂饮食模型。
胆碱缺乏高脂饮食(CDHFD)是一种用于研究肥胖/代谢综合征和NASH联合作用的饮食模型。CDHFD由来自脂肪的45%千卡组成，缺乏必需的营养物质胆碱(以重酒石酸胆碱形式存在)。胆碱的缺乏降低了肝脏分泌极低密度脂蛋白和通过β -氧化代谢脂肪的能力;因此，脂质以甘油三酯的形式储存在肝细胞中。自1960年代中期以来，这种模式的变体被广泛使用。虽然在特定的NAFLD患者人群中报告了类似的代谢特征，但利用胆碱缺乏驱动NASH的生理性可能不如高脂、高糖饮食。尽管如此，由于没有“一刀切”的模型，CDHFD可用于确认和巩固其他饮食模型(如WDs)的发现。
根据作者的经验，与WD-NTF相比，CDHFD在特定时间点倾向于诱导较轻的NASH表型。C57BL6/J小鼠经CDHFD喂养后，体重较WD-NTF喂养后增加更多，皮下白色脂肪组织的增大略大于附睾白色脂肪组织。这与之前的报道一致，因为肥胖的发展被描述为CDHFD模型的核心特征，可能在NASH进展为HCC的过程中起决定作用。CDHFD诱导自发性肝细胞癌的发生率在喂养12个月时约为25%，在喂养15 ~ 18个月时可达75%。尽管在喂养CDHFD的雄性和雌性C57BL6/J小鼠中发现了相似的HCC发生率，但雌性小鼠的HCC发生率有降低的趋势。此外，这些肿瘤似乎在形态学特征、染色体畸变、基因组改变和基因表达模式方面显示出广泛的异质性。
图1：小鼠NASH模型的组织病理学特征及其与人类病理的相关性
在瘦小鼠中建立快速NASH和随后的HCC的CDAHFD模型。
胆碱缺乏的L-氨基酸定义的高脂饮食(CDAHFD;《研究饮食》，A06071302;60% kcal脂肪、非反式脂肪、0.1%蛋氨酸、不添加胆碱和L-氨基酸定义的非酒精性脂肪性肝炎(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)诱导的肝纤维化和肝细胞癌进展较WD和CDHFD加速。重要的是，与允许进行长期喂养实验的传统蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食不同，CDAHFD不会诱导肥胖，但也不会导致显著的体重减轻。CDAHFD可显著升高血清ALT和AST，早在喂养6周时就引起肝脂肪变性、气球样变、炎症和纤维化，12周时出现晚期纤维化。慢性喂养的CDAHFD在24周内诱发肝脏结节。随着喂养时间的延长(24 ~ 60周)，肝脏结节的数量和大小逐渐增加，从喂养36周开始可见明确的肝细胞腺瘤和肝癌。重要的是，喂食CDAHFD的雌性小鼠也会出现NASH的所有特征，但与雄性小鼠相比，其肝损伤、炎症和纤维化程度较低。因此，在24-36周后，与WD或CDHFD喂养相比，CDHFD诱导加速的肝肿瘤发生率接近100%。然而，与对照组相比，喂食含0.1%蛋氨酸的CDAHFD的小鼠仍然保持胰岛素敏感性和正常的葡萄糖耐量;因此，尽管该模型诱导了快速的NASH和随后的HCC，但它没有诱导代谢综合征或胰岛素抵抗。
总体而言，喂食CDAHFD的C57BL6/J小鼠在有桥接纤维化的偏瘦个体中发生了一种NAFLD/ NASH形式，同时保持了其他快速模型(例如MCD)所缺乏的某种形式的慢性。因此，CDAHFD模型为评估NASH和HCC提供了一种快速便捷的方法，但它应该与更多的生理学模型(如WD)一起使用。
遗传和组合模型也很重要。
虽然饮食和生活方式因素在驱动NASH方面发挥了关键作用，但需要注意的是，遗传易感性在NASH以及相关疾病(如2型糖尿病)的发生和发病机制中也发挥了决定性作用，因为并非所有肥胖患者都会发展为2型糖尿病、代谢综合征或NASH。例如，在NASH中，已知有几个驱动疾病进展的危险因素，如2型糖尿病家族史、代谢综合征和PNPLA3基因的rs738409多态性。正如遗传易感性在人类NASH中发挥作用一样，小鼠遗传也被发现影响NASH发病机制。
与人类NASH不相似的广泛使用的毒素/遗传模型。
除了上述模型，许多研究还使用了许多其他的治疗NAFLD/NASH的方案，但它们并不能反映在人类中经常观察到的肥胖/代谢综合征状态和NASH病理生理学。这些模型包括流行的STAM模型、基因毒素DEN与HFD的联合使用、肝毒素CCl4与WD的联合使用以及肝细胞特异性PTEN缺失。
图2：NASH和NASH - HCC模型的流程图描述最适合所关注的问题
如何规范NASH报告:一致性至上。
利用体内和体外NASH模型来识别和研究新的可用于临床的治疗靶点，需要尽可能接近人类病理生理的相似性。NASH是一种动态的多因素疾病，随着时间的推移导致病理特征的积累和进展。这些特征可见于组织病理学(如脂肪变性、气球样变、MDBs)，并进一步表现为代谢并发症(如胰岛素抵抗、糖耐量受损)、细胞和分子免疫应答的慢性(过度)刺激(如CD8+ T细胞浸润和耗竭)以及发展为HCC的风险增加。
重要的是，在小鼠和临床研究中，由于抽样误差和观察者间差异，甚至在组织病理学专家之间，在评估上述病理特征时可以观察到显著的异质性。因此，NASH病理生物学评估方法的研究内和研究间异质性可能导致针对可比科学问题的独立研究的结果不同。因此，在一项研究和不同研究中，NASH表型研究的标准化对于提高实验结果的可重复性和临床转化的有效性至关重要。在这方面，实验设计、相应方案的执行和终点的评估需要保持一致，并进行足够详细的报告。考虑到疾病进展过程中观察到的生理、病理和生化变化，本文提出了一种标准化的NASH小鼠研究报告方案。
疾病负担的评价需要综合考虑多种因素。因此，最重要的是要考虑到疾病的严重程度可能不是沿整个肝实质平均分布的。因此，对于组织病理学和分子分析而言，评估肝脏相同解剖部位(例如相同肝叶)时的一致性可显著提高不同临床前和临床试验结局的可比性。此外，对NASH相关发病率(如脂肪组织炎症、胰岛素抵抗和肿瘤负荷等)的分析也要求标准化，因为治疗干预也应针对NASH相关的肝和肝外并发症。
图3：提出了评价饮食诱导的NASH小鼠模型的报告标准
结论和展望：
NAFLD及其相关合并症已成为巨大的社会经济负担，预计在未来几十年将进一步加重。在NAFLD进展/增加更危险结局(如肝癌或严重心血管事件)的可能性之前，我们仍然缺乏有效的药物在其初期对抗NAFLD。为此，临床前小鼠模型已成为解开NASH驱动机制，以及确定新型生物标志物、预后标志物和NASH治疗候选药物的主要方法。NASH和NASH-HCC的不同模型反映了人类病理学的不同方面;因此，研究者应根据自己的研究仔细选择最合适的模型。此外，研究人员应考虑在不同模型中验证其研究结果，以确定其研究结果的稳健性或特异性。同样，在报告研究结果时应遵循最佳做法，以阐明研究时的疾病及其阶段。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s42255-022-00700-y
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