以下文章来源于生物医学科研之家 ，作者Doc. Cheng
背景：
成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白(CRISPR/Cas9)是一种适应性微生物免疫系统，已被开发为一种稳健、准确、高效和可编程的基因组靶向和编辑方法。这一创新和革命性的技术可以在动物模型、体内基因组治疗、工程细胞治疗、肿瘤诊断和治疗等方面发挥重要作用。CRISPR/Cas9核酸内切酶系统通过单向导RNA (single guide RNA, sgRNA)靶向特定的基因组位点，与靶DNA形成异源双链。化脓性链球菌Cas9/sgRNA:DNA复合物显示具有靶识别和核酸酶叶的双叶结构。CRISPR/Cas9的组装可以被修饰，其纳米制剂可以被设计为递送系统，用于不同的临床用途。然而，将CRISPR/Cas9系统高效、安全地递送到靶组织和癌细胞是非常具有挑战性的，限制了其临床应用。该系统的病毒递送策略可能有许多优点，但缺点如刺激免疫系统、促进肿瘤的风险和较小的插入尺寸超过了这些优点。因此，迫切需要开发一种基于简单纳米制剂的高效非病毒物理递送系统。基于纳米粒子的CRISPR/Cas9递送策略显示出巨大的潜力，如易于大规模生产、联合治疗、大插入尺寸和高效的体内应用等。
简介：
2022年12月，来自沙特阿拉伯卡西姆大学应用医学学院基础健康科学系的Amjad Ali Khan教授课题组在Cancer Commun（IF: 15.2）杂志上发表题为“Current updates of CRISPR/Cas9-mediated genome editing and targeting within tumor cells: an innovative strategy of cancer management”的文章[1]。本文就化脓性链球菌CRISPR/Cas9结构及其机制的研究进展作一综述。此外，本文还讨论了其基于纳米制剂的递送系统的进展，包括基于脂质的聚合物结构和与适配子、TAT肽和穿透细胞肽等特殊配体偶联的刚性纳米粒子。此外，还讨论了CRISPR/Cas9递送和基因组靶向在不同肿瘤中的临床应用、临床试验和未来展望。
主要结果：
CRISPR/Cas9的生物学和作用机制。
CRISPR/Cas9系统是由CRISPR位点编码并伴随着CRISPR相关(CRISPR associated, cas)基因，在许多细菌和古菌中形成了RNA引导的适应性免疫系统。外源质粒、可移动遗传元件和噬菌体DNA的暴露导致其作为一种新的间隔序列整合到细菌染色体中的CRISPR重复序列阵列中。因此，这种整合提供了过去感染的新的基因记录，使细菌能够通过相同的攻击来对抗未来的入侵。CRISPR阵列转录之后是这些转录物的内切核裂解并产生短而成熟的CRISPR RNAs (crRNAs)。crRNA的5 '端包括一个间隔子，一个与外源遗传元件序列匹配的小片段RNA，以及一个具有CRISPR重复序列的3 '端。
CRISPR/Cas9系统可以通过改变向导RNA (gRNA)序列来有效地靶向基因组中的任何DNA序列。在识别靶DNA时，Cas9的两个结构域(RuvC和HNH)在DNA双链下断裂。Cas9产生钝性双链断裂(DSB)，通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)进行修复。这导致在切割位置上随机的小的插入和/或删除(indels)。此外，在DSB位点上，同源修复模板可以实现高保真度的基因组修正。此外，NHEJ引起的提前终止密码子和移码突变的引入分别会导致基因表达的提前抑制和基因敲除。一个20 nt的gRNA序列决定了CRISPR/Cas9系统对DNA的识别和编辑，它不是由蛋白质指定的。
图1：化脓性链球菌Cas9-sgRNA-DNA三元复合物的整体三维结构
Cas9酶的结构和功能。
产脓链球菌的Cas9由1368个具有多功能DNA内切酶活性的氨基酸组成的多域结构。包含两个不同的核酸酶结构域: HNH样核酸酶结构域和RuvC样核酸酶结构域。HNH样核酸酶结构域剪切与gRNA序列互补的靶链。RuvC样核酸酶结构域可损伤非靶链，这与互补链相反。此外，Cas9还参与crRNA成熟和间隔区获取。Cas9的载脂蛋白状态有两个叶:REC叶和NUC叶，具有HNH和RuvC核酸酶结构域，以及CTD。REC瓣由3个区域组成:桥接螺旋(残基60-93)、REC1结构域(残基94-79和308-713)和REC2结构域(残基180-307)。
图2：CRISPR/Cas9系统和相关转录/翻译产物的生物学
癌症细胞内CRISPR/Cas9复合物的递送策略。
CRISPR/Cas9能否在最低限度生物降解的情况下影响靶细胞的治疗效果，取决于其合适的递送策略。给药方式主要分为物理给药、病毒给药和非病毒给药。每种递送方式均有其局限性、优势和并发症。sgRNA和Cas9可以作为质粒、RNPs或sgRNA和Cas9 mRNA的组合被递送到靶细胞内。携带强负电荷的质粒(~ 4.2 kbp SpCas9基因)的递送大多受到阻碍。sgRNA(约31 kDa, 130个碱基)和Cas9 (160 kDa, 4300个碱基)的大尺寸是传统病毒和非病毒递送系统的障碍。此外，质粒转染后还需要转录和翻译阶段，这通常导致编辑延迟。相反，递送的RNPs在蛋白酶降解前具有较快的作用和相对较短的表达时间。然而，这些RNPs的细胞摄取可能具有挑战性，因为其具有较大的蛋白质大小和净负电荷。
图3：CRISPR/Cas9系统对目标DNA的识别和切割机制
CRISPR/Cas9在癌症研究和治疗中的作用。
癌症是全球死亡的主要原因，源于不同的遗传和表观遗传畸变。目前针对这一复杂疾病的治疗策略面临一定的局限性，强调高效替代方法的应用。癌症患者通常表现出不同的基因改变/畸变，这些改变可以显著改变肿瘤的进展和对治疗程序的易感性。在过去的一段时间里，研究人员强调了识别与癌症进展或治疗相关的不同遗传和表观遗传突变的重要意义。ZFNs和TALENs的发现为分析不同基因在癌症中的作用提供了巨大的机会。
由于其基因编辑功能，CRISPR/Cas9已被证明是识别癌症新靶点的有力工具。它现在被认为是研究感兴趣基因的调节和功能的首选工具。该策略用于在细胞群中产生基因敲除，以监测其表型效应。此外，CRISPR/Cas9策略被用于研究与小分子相关的基因-药物相互作用。
利用CRISPR技术研究了不同的细胞类型，如原代细胞、诱导多能干细胞、癌细胞系和类器官。为了检验在特定细胞系中合成致死的假设，如果该细胞系具有遗传病变，并且被认为用特定治疗药物致敏，则使用CRISPR技术。此外，新工程的Cas酶使研究人员能够改变特定的碱基，改变基因组，并修饰原代细胞。例如，Cas9和胞苷脱氨酶融合使研究人员能够修改RNA引导的碱基编辑，这是一种用于编辑不同类型细胞的有前景的技术。
人类基因组由具有增强子、绝缘子和沉默子等调节元件的非蛋白质编码区组成。这些区域的任何失调都可能导致肿瘤的发生。利用CRISPR/Cas9技术研究这些区域也有帮助，特别是顺式调节元件，如增强子和反式作用因子。因此，与CRISPR/Cas9技术相关的这些调控元件的全面知识将有助于理解癌症细胞的基因组图谱。此外，CRISPR干扰也被用于筛选不同的细胞系，以研究lncRNAs对细胞活力的作用。
图4：CRISPR/Cas9以mRNA、DNA或蛋白质形式递送的不同策略
涉及CRISPR/Cas9基因组编辑的临床试验。
第一个涉及CRISPR/Cas9的临床试验是基于非小细胞肺癌(NSCLC)患者的T细胞敲除PD-1 (NCT02793856)。不同的肿瘤细胞表达程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)，与活化T细胞上的PD-1受体结合，抑制细胞毒性T细胞增殖和细胞因子功能。这一通路代表了一种针对内源性抗癌活性的免疫检查点机制。最近还通过使用PD-1或PD-L1的中和抗体治疗了不同的癌症。该基因治疗方法包括收集患者的外周血，并通过CRISPR/Cas9系统对PD-1进行体外敲除。
类似地，针对EB病毒阳性癌症(如胃癌、淋巴瘤和鼻咽癌)的另一项I/II期临床试验涉及对EB病毒特异性自体T细胞进行基因敲除(NCT03044743)。具有CRISPR/Cas9的嵌合抗原受体(CAR)- T细胞已被用于治疗癌症。在另一项临床试验中，利用CRISPR/Cas9将这些CAR细胞递送到T细胞受体α链位点，以增强肿瘤排斥能力。
结论和展望：
CRISPR/Cas9系统因其简单和多功能性彻底改变了基因组编辑艺术，导致其在癌症研究中的广泛应用。对RNA序列的简单重新设计可以使该系统针对任何致癌突变。CRISPR/Cas9介导的基因治疗在临床应用中面临诸多挑战，包括递送系统合适、降解快、半衰期短、靶细胞摄取减少、非特异性摄取、无法逃逸核内体以及某些免疫反应引起的并发症等。由于其高成本和不良反应，使用基于病毒的载体并不是完全有效的递送策略。由于合成纳米制剂的一些新特性，CRISPR/Cas9在靶细胞和组织中的递送显示出其在临床基因治疗中的潜在应用。总之，CRISPR/Cas9系统可以应用于治疗多种癌症，并开发有效的精准药物。通过进一步优化，CRISPR/Cas9系统可以产生有效的抗癌治疗方法，可能克服目前治疗方法所遇到的常见局限性。因此，在不久的将来，癌症患者的生存将得到明显的改善。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cac2.12366
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