以下文章来源于北京生物结构前沿研究中心 ，作者王彤彤
纤毛是一种存在于多种细胞类型中的特殊结构。在人的呼吸道内，呼吸道上皮细胞纤毛的摆动有助于将异物和痰液排出体外 (图1)；在输卵管中，上皮细胞纤毛的定向摆动可以促使卵子沿输卵管向子宫方向运动；而在肾脏里，肾小管上皮细胞形成的纤毛结构在感知机械刺激中发挥重要的作用，其功能的异常与多囊肾的发生密切相关。
图1. 呼吸道上皮细胞通过纤毛摆动将粘液以及病原体排出体外 (原图作者: Sudipto Roy )
纤毛的形成以及纤毛膜蛋白的上膜，离不开一类被称为鞭毛内运输(intraflagellar transport, IFT) 复合物的大分子机器1。IFT复合物由~1,000个蛋白亚基组成，被分为IFT-A和IFT-B2，能够进一步结合马达蛋白kinesin-2或dynein-2以及它们所需要运输的货物3。鉴于其发挥的作用，IFT复合物又被形象地称为IFT train (图2)。
图2. IFT复合物示意图
通常来说，IFT复合物最先在纤毛基部组装，然后通过基部被称为转接区 (transition zone. TZ) 的扩散屏障，进而到达位于纤毛轴丝 (axoneme) 与细胞膜之间的特定区域，该过程被称为顺行性运输 (anterograde IFT)，由马达蛋白kinesin-2介导4；相反，当IFT train运输的货物被释放之后，复合物的结构会发生改变，在dynein-2的作用下回到胞体，该过程被称为逆行性运输 (retrograde IFT)5。在哺乳动物中，由顺行性运输到逆行性运输的转变过程受纤毛顶端的激酶ICK/CILK1调节6。
2022年12月2日，来自伦敦大学伯贝克学院的Anthony J. Roberts和Katerina Toropova共同通讯，在Cell上在线发表了题为IFT-A structure reveals carriages for membrane protein transport into cilia的科研论文 (图3)。文章报道了人源IFT-A复合物整体3.5 Å的结构，揭示了 IFT-A多聚及与IFT-B相互作用的机制。结合复合物结构预测以及生化和细胞水平的分析，文章一步步解释了IFT-A复合物是如何通过β-propeller和TPR (tetratricopeptide repeat) 结构域形成包含接头蛋白TULP在内的“车厢”结构的，并证实IFT-A·TULP“车厢”是包括ICK内在的一系列膜蛋白在纤毛上准确定位所必须的。
图3. IFT-A复合物的冷冻电镜结构
IFT-A复合物整体上由IFT-A1和IFT-A2两部分组成，二者之间以柔性区域连接而成。其中IFT-A2是结构相对稳定的部分，整体分辨率达3.5 Å，而IFT-A1由于其内部的不稳定性以及与IFT-A2之间相对位置的不固定性，整体分辨率仅能达到7.5 Å (图4)。
图4. IFT-A整体结构
从整体层面观察，IFT-A1相对于IFT-A2存在3个轴向上的运动 (视频1)。过去的研究发现，在IFT-A在从纤毛基部出发向顶端运动的过程，独立的IFT-A复合物整体弯曲程度存在差异，这种差异可能正与IFT-A1的活动性相关。
点击观看视频1
IFT-A2由IFT121、IFT122、IFT139和IFT143共同组成 (其中IFT143部分模型借助AlphaFold Multimer搭建)。IFT121和IFT122整体结构相似，均由2个β-propeller以及C端TPR区域组成，二者形成假二次对称。IFT121 CTD (C-terminal domain) 上退化的RING finger结构介导了其与IFT143之间的作用，该界面上的突变与颅脑外胚层发育不良存在密切的相关性。IFT121以及IFT122之间通过β-propeller以及TPR区域形成广泛的相互作用。此外，IFT139 C端α-helix插入到IFT122 N端的β-propeller当中，IFT139上的凹槽结构容纳了IFT122的C端，而IFT143的C端由桥接在IFT122和IFT139之间，IFT-A2亚基之间彼此之间广泛的相互作用为其在结构上的相对稳定性提供了一定的解释 (图5)。
图5. IFT-A2的高分辨率结构
IFT-A1由2对β-propeller共同组成，但由于该部分分辨率过低，无法区分哪对β-propeller属于IFT144，哪对属于IFT140。为了做进一步的区分，研究者构建了N端β-propeller截短的IFT144 (IFT144ΔN) 并进行了复合物的纯化和结构解析，通过对比缺失密度所在的位置 (图C)，对IFT140和IFT144做了进一步的指认，并结合AlphaFold Multimer搭建了复合物的假原子模型。在模型中，IFT140和IFT144，如前述的IFT121和IFT122一样，也通过TPR区域形成广泛的相互作用 (图6)。结合进一步的生化和细胞实验，研究者对TPR区域在二者相互作用中的重要性进行了进一步确认。
图6. IFT-A1结构分析
为进一步了解单个蛋白在IFT train上的定位，研究者将本文所得到的结构与之前cryo-ET得到的顺行性运输的IFT train的密度图进行比对，发现IFT-A2密度能与cryo-ET密度图中多聚体一侧的密度完美地吻合，而IFT-A1能被对接进剩余的密度当中。在整个IFT train中，IFT-A复合物之间互相交织，多聚体中β-propeller和TPR结构域在靠近纤毛细胞膜的部位形成了许多重复排列的开放性腔室 (图中“Compartments”所示部位)，在本文中，这些腔室被形象性地称为IFT train的“车厢” (图7)。
图7. 利用本文结构对cryo-ET得到的IFT train密度图进行分析
通过进一步将IFT-A的原子模型对接到含有IFT-B和dynein-2的cryo-ET密度图中，可发现IFT144的C端区域向下朝IFT-B的方向延伸。过去的生化研究发现，IFT144的C端在与IFT-B亚基IFT88的相互作用中发挥关键作用。在此基础上，研究者进一步对IFT144和IFT88形成的复合物的模型进行了预测，发现IFT88 C端14个氨基酸残基结合在IFT144 TPR17形成的裂隙中，而IFT88上的IFT144结合基序位于从IFT88核心延伸出的无序区域的末端 (图8)。结合细胞水平的实验，研究者对预测模型中参与相互作用的氨基酸残基的功能进行了进一步的验证。
图8. IFT-A与IFT-B之间的关系
TULP3作为TULP接头蛋白之一，在IFT-A介导的膜蛋白的运输中发挥重要的作用。通过利用AlphaFold对TULP3和IFT-A形成的复合物进行结构预测，可发现TULP3 10-40 aa所形成的α-helix结合在IFT122 CTD的通道结构道中 (图9)。当IFT122与TULP3互作界面上的氨基酸残基发生突变时 (IFT122TULPmut)，两个蛋白在分子筛上表现出的结合能力显著减弱，同时细胞水平纤毛长度缩短，相应膜蛋白水平降低。在对IFT122TULPmut细胞的IFT组分进行定量分析时发现，IFT-B、IFT-A和dynein-2的分子标志物均在纤毛尖端富集，提示细胞的逆行性运输出现障碍，这一现象与过去报道的IFT-A本身就足以激活dynein-2从而进行逆行性运输的结论明显不符，提示其他的调节蛋白可能参与其中，而IFT-A·TULP3相互作用界面的破坏可能影响了该蛋白功能的发挥。进一步的分析将目光锁定在了参与顺行性与逆行性运输转变的激酶ICK上，而该激酶在IFT-A·TULP3互作界面被破坏后，在纤毛尖端细胞膜上的水平显著降低。
图9. 接头蛋白TULP3发挥的作用
综上，本文通过运用冷冻电镜、复合物结构预测，结合以结构作为导向的突变、生化和细胞水平的分析，对IFT-A的结构和功能进行了深入的分析，为了解纤毛内部蛋白转运的机制提供了更多分子水平的细节信息。
原文链接
https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.11.010
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