首次在小麦中实现了非基因型依赖的同源重组修复介导的大片段精准敲入

通过同源重组定向修复 (HDR) 进行基因组编辑 (GE) 可以最大程度地实现基因组修饰。先前的基因靶向 (GT) 研究已经证明，具有供体模板的Cas9或Cas12a表达盒的生物分子递送到水稻愈伤组织中允许使用HDR在靶位点进行精确替换或插入，也有研究人员在玉米和大麦中成功实现了基因打靶 。但是，这些策略仅适用于适合细胞培养和可再生的基因型。

2022年12月18日，国际著名期刊《Plant Biotechnology Journal》在线发表了题为“Precise in planta genome editing via homology-directed repair in wheat”的研究论文。作者为了规避与细胞培养和再生相关的限制开发了植物内粒子轰击 (iPB) 的方法，该方法允许在小麦中进行基因型独立的基因组编辑。iPB方法利用芽顶端分生组织 (SAMs)，将Cas9核糖核蛋白 (RNP) 成功递送到SAM中，可以增强基因组编辑的发生，并在后代是可遗传的。由于SAMs具有高细胞分裂活性的特征，许多细胞处于HDR发生先决条件的G2/M阶段（图1a）。

作者设计了一个利用TaSD1作为靶基因座和sGFP作为整合基因的实验。与TaSD1-D基因同源的两个臂与GFP连接并用作供体（图1b），将纯化的重组SpCas9与化学合成的gRNA混合形成CRISPR/Cas9 RNP。然后将涂有CRISPR/Cas9 RNP的金粉颗粒和供体DNA通过粒子轰击递送到小麦胚SAMs 中。研究中共使用了两种金粉涂层条件：条件A，2700 µ g金颗粒和8 pmol供体DNA；条件B，1440 µ g金颗粒和16 pmol dsDNA供体。轰击的胚胎在体外生长，直到生长出叶子和根，然后移栽到土壤中进行生长。

对从轰击的胚胎中生长的E0植物进行筛选，以检测HDR的发生。作者从2400个粒子轰击的事件中共检测到7个预期重组事件（图1c）。来自B130和B183的扩增片段略大于从A11，A172，B109，B271和B364获得的片段。对这些PCR产物的测序表明，GFP片段通过HDR在植物A11，A172，B109，B271和B364中精确插入目标D基因组位点。部分HDR发生在B130和B183中，其中右同源臂被精确替换，左同源臂通过非同源末端连接插入目标位点（图1d）。总的来说，这些数据证实了RNP和供体DNA共同递送到SAM中在小麦中获得HDR事件的方法是可行的。

为了测试GT是否可遗传给下一代，从阳性E0植物中收获所有E1种子并进行基因分型。通过PCR筛选仅获得5株阳性E1植物 (A172-1、B271-6、B271-16、B364-10、B364-14)。用亚基因组特异性引物组进行PCR分析，以及Sanger测序，确定A172-1、B271-6、B271-16、B364-10和B364-14是杂合子突变体，其中GFP片段被精确地插入到靶D基因组位点。在条件A (图1h) 下，作者从总共1176个轰击的SAMs中获得了2个具有完美HDR事件的E0植物。获得HDR植物的效率在E0代为0.17%，在E1代为0.08% (图1h)。然而，在条件B (图1h) 的情况下，从1224个轰击的SAMs中获得了总共3个完美HDR E0植物和2个部分HDR E0植物，并且GT在其中两个中是可遗传给下一代的。在E0代中，HDR效率从0.17% 增加到0.41%，包括部分HDR事件，在E1代中从0.08% 增加到0.16%。

为了进一步提高编辑效率，作者使用更少的金粉颗粒 (1080微克) 和更多Cas9 RNP (25微克) 的涂层产生了更高的HDR效率；在E1代中分别0.86% E0和0.34% (图1h)。这些数据表明，较大量的Cas9 RNP和较少量的金粉颗粒可以提高GT效率。

综上所述，这是第一个在小麦中报道的精确基因敲入事件。作者报道了一种通过将Cas9 RNPs和dsDNA供体递送到小麦SAMs来实现基于HDR的基因组编辑的新方法。从2980个轰击的SAM中获得了10个具有完美HDR事件的E0植株。使用SAMs来实现HDR可以避免基因型依赖性对转化和再生最佳能力的限制。该策略可以成功地利用CRISPR介导的HDR将一些优良性状引入某些商业作物中，而无需依赖在转化和再生程序方面具有很高能力的品种。总之，这一进步具有巨大的潜力，可以迅速改善商业作物的重要农艺性状。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.13984

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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