全基因组关联分析在植物病理研究中的应用

随着植物病害的数量和严重程度的不断增加，我们需要更好的了解植物免疫和病原体侵袭的遗传分子机制。在植物病理中开展GWAS的研究，能够帮助我们了解多种病原体防御反应的遗传结构，进一步鉴定出新的防御机制。回顾以前的研究，植物病理的研究主要是通过研究人工遗传变异来解决问题。例如公共突变体的筛选和基于表型差异开展的基因定位和克隆。这些方法也让我们对植物免疫中的一些关键分子机制有一定的了解，例如PAMP触发的免疫反应（PTI），效应子触发的免疫反应（ETI）以及一些微生物的致病决定因素（鞭毛蛋白、分泌系统和效应子）。通过利用植物和病原体中的自然遗传变异，出现了一种名为GWAS-mapping策略，其旨在通过NGS测序技术和定量遗传学等统计学方法用于发掘其中的关键位点。2022年12月13日，来自法国图卢兹大学的Fabrice Roux 团队在Trends in Plant Science 上发表了题为“Genome-wide association studies in plant pathosystems: success or failure?”的综述论文。在本文中研究人员列举了过去18年来发表的162篇文章清单，回顾了植物病理142篇文章中的271个GWAS结果。研究人员阐明了GWAS方法在植病研究中的发展，并且帮助大家了解植物对于不同类别病原体的复杂抗性表型的鉴定以及如何鉴定新的遗传和分子防御机制。最后强调了在生态时间尺度上确定强大而又持久的耐药性机制的重要性，作者提出了未来的研究途径，以更好地理解疾病三角（某些疾病更常见于某些地区或种群。这种偏好可能与环境因素、基因因素、种群因素等有关）背后的遗传学机制。

构成致病菌群的多种病原微生物经常同时或者依次侵染植物，而当病原体的危害在不断上升时，可能会造成植物种群的生态进化轨迹发生改变、作物产量的降低，造成经济损失和降低粮食安全。与人类和动物病原体一样，植物病原体随着全球化的加剧，其对植物的负面影响在不断增加。再加上全球人口的不断增加，对可持续食品供应的需求在不断增长以及需要减少杀虫剂使用的依赖，这些都需要通过建立起跨学科的研究，例如结合生态学、遗传学、分子生物学和数学建模等方法进行紧急敢于。通过提出一定策略防止疾病的爆发，例如生物防治剂的开发以及植物特化代谢物（specialized metabolites ）等一些天然产物的使用，基于基因的植物抗性。而以上这些手段都需要更好的了解植物免疫和病原体侵染的潜在机制，这将反过来有助于我们寻找到新的、持久的和可持续的控制植物病害的方法。

图1：全基因组关联分析原理

1.复杂的表型数据

作者对植物病理的文章进行了筛选，只保留那些具有作图群体并且每Mb中至少包含一个分子标记的文章。虽然这个标准减少了大基因组物种的文章数量，但也能让我们以一个低偏差的方式对当前关于抗病性遗传结构的认识得出一个初步的印象。此外，当对不同致病物种，不同致病菌株、不同作图群体或者不同环境的GWAS分析时，我们将相应的GWAS视为独立的。最终确定了在143篇文章中确定了252项GWAS研究。我们将252个GWAS分析分为3类：野生物种、农作物和树木。2005年，在拟南芥中GWAS分析首次得到了证明并且成功地对先前已经克隆的存在/不存在超敏反应基因进行了精细定位。从那时起，相应的GWAS研究在植物中爆发，在作物中四分之三的GWAS是针对该7个物种进行的大豆、玉米、水稻、菜豆、高粱、油菜和木薯。虽然小麦作为第三的粮食作物，但由于其复杂的基因组以及低密度的分子标记导致相应的GWAS研究比较少。因此随着基因组测序的不断完善、不断完整的遗传结构，未来几年这些作物的抗病性将会得到分析。我们发现野生物种、作物中四类病原体中开展的GWAS研究比例存在不平衡。在野生物种中研究最多的微生物是细菌病原体、其次是oomycetes 和真菌；而在作物中大部分是真菌病原体，其次是病毒病原体。对于感病器官的评估也观察到了相当大得不平衡，如71.4%的GWAS研究与叶片相关，而18.6%和13.1%的GWAS与茎和根相关。这种不平衡可能是由于对植物地下性状进行表型分型比较耗时所造成的。并且对疾病严重程度进行评估主要是基于二元分类或者半定量方式（存在/不存在过敏反应）。而可见的症状并不能总是反映出植物中病原体的生长动态，疾病的严重程度也可以通过估计病原体的数量来大约地估计；最后也可以通过量化植物防御反应中的生物标志物作为GWAS分析中的表型。生物标志物就包括专门的代谢物，例如小分子激素、水杨酸以及茉莉酸反应基因的表达。

图2：植物中开展的GWAS研究统计

2.植病分析中的遗传结构

抗病性GWAS在许多方面都取得了成功，类似于那些使用传统连锁作图群体的方法。例如RIL、NAM以及MAGIC群体，两种类型的方法都显示了共同的遗传结构模式。与由R基因介导的定性抗病性相比、定理抗病性（QDR）在野生物种和作物中更为普遍，因此在93.4%的GWAS分析中，疾病反应的遗传结构被解释为多基因效应。此外类似于其他类别的表型研究，植物-病原体的相互作用进行的GWAS研究中不可忽略的一部分就是等位基因异质性的存在。此外疾病的建立和发展是动态的，GWAS的关联峰可能仅在感染的早期或者晚期被检测到。

3.GWAS分析的优势

只能在GWAS中开展的研究。首先就是与传统的连锁作图方式相比，GWAS明显的缩短了QTL精细定位的时间。这种快速精细定位的方式将会导致功能验证的QTL数量不断增加。而反过来，GWAS中识别了大量的候选基因，也揭示了一些很少被认为与植物免疫相关的自然变异具有广泛的分子功能。经过验证的候选基因可以进一步的成为破译抗病性信号机网络机制的起点。在不同的地理环境下可以观察到相似的具有多样性的抗病性表型。例如拟南芥中QDR的遗传变异水平在全球收集的物种中和法国当地的种群之间是相似的。然而，抗病性的遗传结构在很大程度上是取决于地理范围的，这种在不同地理尺度上开展GWAS研究时结果的差异或者互补性可能是由于人口结构的影响导致的。涉及到物理位置上不连锁的QTL之间存在长距离LD的上位性网络可以解释不同性状中不可忽略的一部分表型变异。例如在拟南芥热应激下，确定了一个由7个QTL组成的复杂的染色体间上位性网络，而在没有热应激是则没有检测到上位性；这不由地让人们质疑这种高阶相互作用的相对重要性。抗病性QTL之间是否存在复杂的上位性关系仍旧是一个悬而未决的问题。并且上位性的功能验证QTL也还存在挑战，除非多个CRISPR-Cas9相关蛋白用于创建双重、三重、四重等突变体。最近，通过联合关联分析（co-GWAS）方法在拟南芥-木黄单胞菌的研究中揭示了具有强等位基因效应、特异性抗性QTL和具有小效应、广抗性QTL的存在。重要的是，在这项研究中QDR更大比例的方差是由于木黄单胞菌株之间的遗传多样性所解释的，而不是宿主拟南芥的多基因效应；这项研究强调了在病原体中与致病性相关自然变异QTL的重要性。

图3：植物和病原体全基因组关联研究 (GWAS) 的成功概述

4.抗病性GWAS相较于其他性状GWAS落后原因

病原体进化创新可以让病原体绕过寄主植物中原有的监控系统，是作物时常发生新流行病害的主要原因之一。虽然识别致病性的基因（如效应子、参与营养基因、细胞壁降解等）是提高作物抗病能力的一种育种策略，但是在遗传水平上病原体如何规避宿主内的防御机制仍旧是未知的。令人惊讶的是利用自然变异解决微生物致病性机制的研究是远远少于利用突变等反向遗传学手段。那么为什么很少有研究使用GWAS方法来识别植物病原体致病的候选遗传决定因素呢？首先一个原因可能是植物和病原微生物的种群遗传学的知识仍旧刚刚起步，例如无性繁殖细菌的遗传多样性比较低，从而导致其LD衰减区间相对较长。然而来自拟南芥自然种群中数百个菌株的测序揭示了基因组内广泛的变异存在，co-GWAS方法也表明X. arboricola 中相对较短的 LD 衰减。另一个原因可能是菌株群体的数量比较少的原因。

5.展望

在植物病理系统中，无论其是发生在农田还是野生栖息地，植物和病原体之间的分子对话仍旧有很多等待发现。这里作者提取几点建议用于更好地解码植物和病原体之间的遗传和分子相互作用。首先，需要对野生物种、蔬菜、作物和树木进行GWAS的研究，以比较不同植物类别之间的遗传结构。除了确定新的分子植物防御机制外，克隆QTL和破译其在全基因组中相关的分子网络可能会发掘出更多的候选基因列表。这也反过来促进为了GWAS中候选基因的识别，验证未来的基因组关联。为了更好的表征病原体的遗传结构，就需要从天然宿主中建立大量的菌株，以提高病原体的遗传多样性水平，从而预测未来病原体爆发是的潜在致病决定因素。最后，提高我们对疾病三角的认识需要破译植物和病原体相互作用的遗传结构以及其与环境之间的相互作用。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.tplants.2022.11.006

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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