CRISPR-Cas基因组编辑技术的广泛应用已经彻底改变了功能基因组学。然而，作为有效基因组编辑的重要步骤，人们对于细胞如何修复由Cas蛋白切割造成的DNA双链断裂还知之甚少。早期对包括酵母与人类细胞等传统模式系统的研究表明多条不同的修复通路包括非同源末端连接 (Canonical Non-homologous end joining, C-NHEJ), 同源重组 (Homologous recombination, HR), 微同源末端连接 (Microhomology-mediated end joining, MMEJ or Alternative end joining, a-EJ) 与单链退火 (Single strand annealing, SSA) 协调参与到DNA双链断裂的修复。然而, 对于其他物种，主要的研究集中于非同源末端连接与同源重组，缺乏对微同源末端连接与单链退火的报道。植物病原真菌稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）不仅能侵染水稻造成严重的稻瘟病，同时也作为模式物种被广泛用于研究真菌与植物互作。
近日，美国堪萨斯州立大学David E. Cook课题组在Nature Communications在线发表了题为 “CRISPR-Cas12a induced DNA double-strand breaks are repaired by multiple pathways with different mutation profiles in Magnaporthe oryzae” 的研究论文，利用Cas12a基因组编辑与多种测序技术阐明了稻瘟病菌中多条不同的DNA双链断裂修复机制及其对应的突变结果。
为了在稻瘟病菌中建立CRISPR-Cas12a的编辑系统，作者首先利用体外组装合成Cas 核糖核蛋白复合体 (RNP Complex) 的方法在稻瘟病菌中靶定了黑色素调控基因BUF1。由于BUF1基因的敲除会造成稻瘟病菌呈现浅黄色 (buff) 的菌丝，通过观察菌丝色素的变化，作者发现Cas12a RNP编辑系统呈现了极高的编辑效率。然而，在进一步的基因型鉴定中，除了少量的插入缺失 (INDEL) 与DNA供体插入 (Simple insertion), 作者们发现BUF1基因在一大部分的浅黄色突变体中无法PCR扩增。这种PCR无法扩增基因区的现象在多种实验设计和不同野生型菌株中均可重复。
Cas12a RNP编辑系统在BUF1基因上产生了意外的基因型鉴定结果
为了解析这些菌株中具体的突变结果，作者利用纳米孔长读值测序技术 (Nanopore MinION long-read sequencing) 对多个具有buff浅黄色突变体表型但无法PCR鉴定的菌株进行了测序。通过从头基因组组装 (De novo genome assembly), 作者们发现了三种不同类型的大范围突变：(1) 大量插入 (Large insertion), 多达17 kb的供体DNA以串珠 (Concatemer) 的形式插入到BUF1位点; (2) 大量缺失 (Large deletion), 多达21 kb的BUF1基因及其邻近序列的缺失。有趣的是这些缺失都发生在重复序列MGL/MINE之间，与单链退火修复的模式类似；(3) 缺失与插入 (Deletion plus insertion) , BUF1邻近序列的缺失与DNA 供体的插入并存。利用原始测序读值的mapping, 作者进一步确认了大范围DNA缺失的存在。与此同时，作者利用Sanger 测序发现了DNA供体与其插入位点经常分享着部分的微同源序列，这也与微同源末端连接修复的模式相似。就此，作者推测稻瘟病菌中存在着多种不同的DNA修复途径来修复Cas12a靶向的DNA双链断裂。
纳米孔长读值测序鉴定了多种异常的BUF1 DNA突变模式
为了测试这些异常的修复结果是否是由于BUF1位点的不稳定性所造成的，作者通过Cas12a靶向了另外四个不同的位点，并进行突变结果的分析。数据显示上述异常的DNA突变结果也可以在另外的位点观察到，但是具体突变事件的概率在不同位点并不一致。其中，在一个效应因子BAS4位点上，作者观察到了接近百分之五十的大范围缺失事件 (包括大量缺失和缺失与插入)。令人惊奇的是，通过纳米孔长读值测序，作者发现了多达56 kb从BAS4直到端粒区的缺失，同时也发现了可能由重复序列Copia介导的多达17 kb BAS4与邻近区域的缺失。这些结果首先明确了在BUF1位点上观察到的异常DNA修复的结果，并不是BUF1位点独有的；其次建议了不同的位点可能由于细胞生理学与基因组特征的差异导致了不同DNA修复通路使用的倾向性，例如BAS4接近亚端粒区的特性很可能造成了其大量的大规模DNA缺失事件。
纳米孔长读值测序鉴定了来自亚端粒区BAS4位点的大范围DNA缺失
进一步的实验表明作者所观察到的异常DNA修复结果并不取决于筛选的过程 (潮霉素或G418 w/ DNA 供体 vs FK506 w/o DNA 供体) 与所利用的Cas核酸酶 (Cas12a vs Cas9)。
最后为了从遗传学角度确认稻瘟病菌中存在着猜测中的多种DNA双链断裂修复途径，作者敲除了非同源末端连接途径 (C-NHEJ) 所必须的Ku80蛋白。利用FK506对于其受体基因FKBP12的直接筛选，作者在不使用DNA供体的情况下，发现在Δku80突变体，PCR无法鉴定 (PCR-negative) 的大范围缺失突变体显著增多, 这与KU80在C-NHEJ途径下保护DNA末端的功能相符，并且很有可能是由于单链退火 (SSA) 或者同源重组 (HR) 途径所导致的。在剩余的可以PCR鉴定 (PCR positive) 的突变体中, 作者在Δku80突变体发现了更大的DNA缺失伴随着在缺失边界更长的微同源序列。这很可能是由于微同源末端连接(MMEJ or a-EJ) 途径所导致的。这些结果证明了在稻瘟病菌存在着C-NHEJ与非C-NHEJ介导的修复途径。
Δku80缺失导致的微同源序列介导的DNA缺失
综上所述，作者利用Cas12a基因编辑和稻瘟病菌，从多个靶向位点，阐述了由不同DNA修复机制导致的DNA修复结果的差异性。结果建议了多条DNA修复途径在不同位点使用的偏向性有可能导致了真菌基因组偏向进化 (Biased variation) 的产生，对理解真菌基因组的编辑与进化具有着深远的意义。
堪萨斯州立大学植物病理系黄峻博士为该论文第一作者， David E. Cook副教授为该论文的通讯作者，Cook课题组成员David Rowe、Pratima Subedi、张伟博士与 Barbara Valent 院士团队参与了研究。本研究得到了美国USDA和NSF等项目的支持。
Cook课题组主要致力于研究真菌-植物互作过程中的动态调控（稻瘟病菌基因组、表观遗传、DNA修复等领域）与植物生物技术 (RNA编辑、合成生物学与机器学习) 的开发，近年来取得了一系列研究成果，以第一作者或通讯作者相继发表在Nature Communications、Genome Biology、FEMS Microbiology Reviews、 eLife、PLoS Genetics、Scientific Reports、STAR Protocols等国际期刊。
据悉，Cook课题组有意在合成生物学与机器学习等方向招聘博士后研究员，欢迎有植物分子研究相关背景的博士毕业生加入。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-022-34736-1
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
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