WB蛋白样品完全变性后是否就足够稳定了？我们做了一组实验...

以下文章来源于ProteintechGroup ，作者研发部

制备成功的蛋白样品在存放一段时间后再次检测目的条带不见了,Why?

转移后的膜通过考马斯亮蓝染色条带很浅甚至看不到任何条带，Why?

一直结果很好的样本再次检测时泳道上端出现了“鬼带”，Why?

说好的蛋白完全变性后就足够稳定了吗？为什么会出现这种情况？同为科研人员的小P也只能感慨：“蛋白质的世界太复杂!”

带着这些“Why？”小P开始了漫长的探索之旅，最终也找到了一些答案。接下来，我们就用实验数据一步步的揭开蛋白样品在完全变性后还会发生的那些变化!

01

内源性剪切

首先最容易发生的是内源性剪切，也就是我们常说的“样品降解”。蛋白样品在经过100℃沸水煮样后，蛋白质处于完全变性失活的状态，理论上是不具备内源性剪切的能力，但现实是完全变性后的样品仅仅是抑制了样品降解的速度，随着保存时间的延长，样品的降解会逐渐的被放大而显现出来。

如上图所示，蛋白样品在当年制备完成后的SDS-PAGE染胶结果条带清晰且蛋白质谱完整；在经过数年的保存后，蛋白条带明显变少且模糊，尤其是胶的上端大分子蛋白区域，几乎看不到任何条带，说明此部分的蛋白已经完全降解。

02

蛋白聚合形成复合物

其次是蛋白质-蛋白质之间的聚合形成复合物。现制样品的蛋白完整性通常是样品的最佳状态，无论是蛋白质的降解程度、蛋白质-蛋白质之间形成的复合物程度都是最低状态。

随着保存时间的增加、反复冻融次数的增加等因数影响，样品中的还原剂组分（如DTT和beta-巯基乙醇）会逐渐的氧化或挥发而失效，此时我们认为的“稳定”变性状态会悄然的发生改变，变得不再稳定，蛋白质-蛋白质会相互的结合而形成聚合物。

当我们再次使用时则会出现堵塞浓缩胶和分离胶加样孔口的现象，如下图：

当然肯定会有细心的伙伴们反问：“怎么确定就是还原剂失效引起的呢？”就此小P也反问过自己，所以也针对此反问设计了一系列的实验。考虑到WB常用的细胞或组织样品蛋白种类多，不易观察其变化，所以小P选了一款mouse IgG作为测试样本。

使用不同浓度的还原剂（DTT和beta-巯基乙醇）去打开mouse IgG的二硫键，同时100℃沸水煮样使其充分变性，制备成浓度为3μg/μl的样品，每管平分为3组，第1组现制现用，第2组室温放置7天后使用，第3组-20℃保存半年后再使用，每组均做SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色检测，实验结果如下：

通过此对照实验我们可以清晰的发现，mouse IgG样品在受温度和存放时间的影响，样品中的还原剂逐渐的失效，完全变性的样品也变得不再“稳定”，蛋白质之间聚合形成各种大小的复合物而堵在了分离胶进样孔口。

与之对应，保存一段时间后的样品再次使用时，补加适量的还原剂重新煮样，我们可以观察到此类复合物被打开，样本堵孔现象好转。（下一篇咱们将着重介绍“样本堵孔”难题，数据且看下一篇。）

对于蛋白种类更多的细胞和组织样品，形成的复合物会更加的复杂，浓缩胶和分离胶加样孔同时被堵住的现象时常发生，甚至会将整个浓缩胶一段全部堵住。最为可怕的是我们的样品在保存过程中内源性剪切和蛋白聚合形成复合物是同时进行，这也是导致我们明明很好的样品在存放数年后跑胶看不到任何条带的原因。

实验小结

通过上述一系列的实验，各位小伙伴应该都明白了吧：

蛋白完全变性后，依旧不是那么“稳定”!

制备好的样品我们还需尽快使用，如需保存可以分装成小份保存在-20℃或-80℃冰箱，避免反复冻融。保存半年以上的样品再次使用前需补加适量的还原剂重新煮样后再使用。

以上就是小P摸索到蛋白完全变性后稳定性的一些小经验，你学会了吗？

转自：“医学科研小坑”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！