以下文章来源于生物医学科研之家 ，作者Doc. Cheng
背景：
通过肿瘤的导航、进入血管系统、在循环中存活、在远处部位退出和恢复增殖是肿瘤细胞成功转移的所有步骤。肿瘤细胞完成这些步骤的能力高度依赖于这些细胞与肿瘤微环境(TME)的相互作用的时间和顺序，TME包括基质细胞、细胞外基质和可溶性因子。因此，TME在确定肿瘤的总体转移表型方面起着重要作用。TME的复杂性和因果动力学目前无法在体外重现，也无法从固定组织的研究中推断，最好是在体内进行实时和单细胞分辨率的研究。活体成像(IVI)提供了这些功能，近年来该领域取得了巨大的发展和创新。
简介：
2022年11月16日，来自美国Gruss Lipper生物光子中心，阿尔伯特爱因斯坦医学院/Montefiore医学中心的David Entenberg教授课题组在Nat Rev Cancer（IF: 69.8）杂志上发表题为“Intravital imaging to study cancer progression and metastasis”的文章[1]。本文综述了近年来关于肿瘤动物模型IVI的研究进展，并阐述了如何利用IVI来了解癌症的进展和转移，以及开发新的治疗方法和疗法。我们描述了可以获得一系列组织和癌症类型的新技术、允许命运图谱和探测功能和表型状态的新型荧光报告和生物传感器，以及应用这些技术、报告和生物传感器研究癌症所产生的临床应用。最后，作者将介绍该领域仍然存在的一些挑战，如何解决它们以及对未来的展望。
主要结果：
多光子IVI研究进展。
多光子IVI简介。
共聚焦和多光子显微镜的基本原理，以及IVI及其历史，已经在许多出版物中进行了描述，为这些成像方法如何生成完整组织的单片图像提供了很好的解释。他们描述了共聚焦显微镜如何通过在探测器前用针孔阻挡失焦光来实现这一目标，以及多光子显微镜如何通过使用超快脉冲红外激光源来限制产生的信号到焦平面，这种激光源只允许吸收发生在样品中具有最高光子密度的区域(即焦平面)。共聚焦和多光子显微镜可以非破坏性地产生与标准组织病理学的机械切片组织切片相当的光学切片图像。
提高多光子IVI的可及性。
虽然IVI通常被认为是一种技术上困难的过程，需要专门的设备和重要的技能，但在过去十年中，IVI的使用有了显著的增长，采用它的障碍也大大减少了。这些进展包括大量新显微镜技术的出现，用于识别细胞类型和生化途径的荧光生物传感器，以及用于访问全身各种组织(短期和长期)的协议。尤其重要的是，许多用于获取和稳定组织的手术方案使多种小鼠器官(包括脑、肝、提睾肌、脊髓、乳腺和肿瘤、卵巢、肾脏、淋巴管、淋巴结、唾液腺、肺，甚至发育中的胚胎)能够进行延时活体多光子成像。图1所示的图像是可以成像的组织范围和种类的示例，并直观地展示了IVI如何超越了模糊的黑白图像的日子，提高到现在可以与体外或离体研究相媲美的水平。
图1：从多种组织获得的活体成像示例图像
扩展成像的空间和时间尺度。
TMEs具有异质性的血管化、细胞外基质和细胞密度，这些可能反映了癌症进展的不同步骤，需要在不同的空间尺度(从亚微米到整个肿瘤)进行评估。为了在这些巨大的不同尺度上记录事件，有必要以亚细胞分辨率(~0.25µm /像素)捕捉大体积肿瘤组织(~ 1-2 mm3)的图像。遗憾的是，用标准的多光子显微镜无法捕捉到高分辨率的低倍图像，这依赖于高倍、高数值孔径物镜来产生高效和明亮的信号。这限制了所获得图像的视场大小，并导致组织的严重采样不足。这种影响在图2a中得到了说明，图中只展示了一个名人照片中的几个小区域。仅仅从这些小区域，是不可能辨别主体身份的。
一种解决方案是以连续的马赛克模式获取被摄者的许多高倍、高分辨率图像(图2b)，然后将它们拼接在一起，产生一个低倍图像，可以揭示被摄者的潜在身份(图2c)，这一过程被称为“大体积、高分辨率”(LVHR)成像。将LVHR应用于IVI (LVHR-IVI)48比传统IVI产生了更全面的肿瘤视图。图2d演示了通过LVHR-IVI技术可以获得的图像类型。因此，LVHR-IVI允许研究人员以类似于病理学家使用福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的方式使用IVI图像，在这些切片中，肿瘤侵犯的范围和感兴趣的区域首先在低倍镜下被识别，然后在高倍镜下进行更详细的分析。利用组织形态学，可以识别基质区域(缺乏内皮细胞或上皮细胞的区域)和新生血管。因此，根据标准的组织病理学标准，LVHR-IVI可以区分关键的生物学和病理学过程(例如，区分乳腺导管原位癌(DCIS)与晚期癌或分支导管)。然后可以在更高的放大倍率下进行更详细的分析，确定与肿瘤进展和播散相关的生长模式。
转移性定植的成像。
IVI用于研究转移性定植过程的最早应用之一是Wood，他在1958年使用了一个植入兔耳的透明腔(由Sandison在30多年前开发)。Wood用这个透明腔来观察直接注入血管的肿瘤细胞的命运。从那时起，人们在许多不同的癌症类型和组织中研究了次要部位的转移定植。这些研究详细描述了转移性定植的过程，将其从一个简单的描述性概括短语转变为一个包含几个单独步骤的过程，包括癌细胞到达、外渗、生存和生长为继发性结节。
淋巴管和淋巴结。淋巴管和淋巴结局部区域播散的IVI决定了对肿瘤施加的机械压力可以增加肿瘤细胞向引流淋巴结的运输。然而，Das等表明，在未受到干扰的组织中，肿瘤细胞通过活跃的肿瘤细胞迁移进入淋巴窦，并且可以通过阻断细胞因子受体C-C基序趋化因子受体8 (CCR8)来阻止肿瘤细胞进入淋巴窦。虽然淋巴结转移灶(阳性淋巴结)的出现与患者较差的结局相关，但直到最近才发现(使用固定组织分析)阳性淋巴结中的癌细胞可以向远处转移。阳性淋巴结的IVI可以更好地理解癌细胞向远处再播散的机制，并导致新的靶向治疗。
肺。一个更具有挑战性的组织是肺。它的微妙而复杂的性质已经使它成为自16世纪以来成像的目标,早在1925年就有报道。该组织发现,与正常血管相比,血管转移结节的血管结构减少,血流减少。最近,Headley等人使用这种成像窗口显示,在进入肺、DTCs片段后,释放在肺间质中积累的肿瘤微粒子,产生免疫反应。最后,作者的小组开发了一个植入式成像窗,允许小鼠生存,第一次给出肺血管的多个观点。这个窗口可以用来直接可视化DTCs的到达和溢出,并在它们成长成微函数时跟踪它们。这一研究表明,原发性肿瘤的TME在迁移的癌细胞中诱导了一种侵入性、干细胞和休眠表型,给这些细胞一个生存优势,在转移性部位,当条件变得合适时,它可能会成长为转移性结节。
脑。一种类似的纵向IVI研究跟踪了大脑的DTCs,并观察到在大脑停止血管分支点的DTCs,在到达后不久就渗透出来,并与微血管保持密切接触。在外渗后,癌细胞的生长发生在癌症类型特定的模式中,黑素瘤转移使用血管联合选择(血管周长)和肺癌的转移酶形成结节引起血管生成。另一项最近的研究是使用大脑的序列IVI,表明从休眠中逃脱是大脑转移发展的一个限制因素,星形胶质细胞驱动DTC休眠。
肝脏。第一次IVI对肝脏转移的调查观察了纤维肉瘤DTCs的到达,并发现细胞在狭窄的肝窦体中被机械地吸收,没有明显的血小板影响。这是Scherbarth和Orr证实的,他发现B16黑素瘤细胞被机械地困在肝窦状体中。然而,他们还发现,用促炎性细胞因子白细胞介素- 1α(IL-1α)对小鼠的预处理导致肿瘤细胞粘附于血管内皮表面,这是肿瘤细胞大小的两倍多。Schlüter等发现结肠癌细胞株有较高的粘附率,独立于其转移电位,而DTCs在直径比粘附瘤细胞大得多的微型容器中被逮捕。这些研究表明,除了血管的大小,可产生的可溶性和癌症细胞的内在因素影响肝脏的转移性。
图2：大体积、高分辨率活体成像
转移播散的成像。
了解肿瘤细胞如何内渗对于发现降低总体转移负荷的方法至关重要。阻断血管内灌注可用于接受全身性术前(新辅助)治疗的局部和区域疾病患者，这些治疗在某些情况下可能会增加血行播散。此外，在原发肿瘤切除的患者中，阻断播散可能仍然重要，因为越来越多的证据表明，血源性播散也可发生于转移病灶。事实上，循环肿瘤细胞的相对数量是转移性乳腺癌、结肠癌和胰腺癌的重要预后和预测因素。尽管了解肿瘤细胞如何进入血管系统很重要，但关于这个问题的答案仍有相当大的争议。存在两种(不相互排斥)理论:一种是集体迁移，然后是集体血管侵袭;另一种是单细胞和流式(协调的单细胞)迁移，然后是单细胞内渗。
IVI发现的临床转化。
转移的生物标志物。
IVI在转移级联反应方面的一些发现已成功转化为能够预测患者转移复发的生物标志物。特别是，TMEM门静脉密度与远处复发，特别是早期复发(诊断后5年)显著相关，MENACalc与三个乳腺癌队列的死亡风险呈正相关，独立于其他传统测量的临床参数。这些回顾性研究包括数千例患者，它们证明了通过IVI获得的见解如何能够产生针对转移性播散的特异性预后检测方法。此外，诸如TMEM门口评分等测试与测量增殖的测试(例如Oncotype DX乳腺复发评分)的相关性非常差，这一事实证实了TMEM门口相关预后正在测量一个独特的生物学过程。
通过IVI观察到治疗对TME的影响。
IVI已被用于证明全身治疗(如化疗、放疗、靶向治疗和抗血管生成治疗)对TME的影响，这一现象被称为宿主反应。原发肿瘤和转移部位的TME变化(例如骨髓源性祖细胞的流入或原发肿瘤内免疫应答的调节)可影响药物递送、癌症进展、癌症播散和耐药性。全身性治疗依赖于将药物递送至TME(在体内研究最好的动态过程)。许多关于药物递送的重要结论都是在IVI的帮助下得出的。IVI已经表明肿瘤血管对亚细胞大小的纳米颗粒具有渗透性，这导致了肿瘤床中血管“渗漏”增加的概念，并将这种渗漏与不良的治疗递送联系起来。
图3：高分辨率活体成像有助于我们理解各种疗法对肿瘤微环境和癌症表型的影响
结论和展望：
目前的共识是，TME决定肿瘤表型和对治疗的反应，其方式超越驱动肿瘤生长的基因突变。理解TME作用背后的机制需要在活体动物中以单细胞分辨率进行实时和纵向观察。目前，多光子IVI已经发展到可以作为研究TME及其在宿主反应中的作用的主要工具的阶段。
最后，IVI在阐明临床观察到的治疗失败，特别是与TME变化相关的治疗失败的机制方面发挥了核心作用，并指出了可克服这一失败的最佳药物组合。由于癌细胞和TME之间的相互作用通常是动态的，IVI将继续成为了解癌细胞在其自然环境中的行为方式的选择，纵向上在癌症进展和对治疗的反应。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41568-022-00527-5
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