导读
从红芸豆（RK）中提取的粗多糖在2型糖尿病（T2DM）小鼠中显示出显著的抗糖尿病活性，但其潜在机制和核心功能成分尚未被阐明。本研究通过血清代谢组学和高通量测序研究RK的抗糖尿病作用和机制。此外，我们通过评估2型糖尿病大鼠血糖和血脂稳态的改善情况，确定了关键成分。我们的数据表明，RK可以缓解链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠高血糖、高血脂症状。RK不仅通过调节不饱和脂肪酸的生物合成来改善代谢紊乱，而且通过选择性地富集拟杆菌属、考拉杆菌属、琥珀酸弧菌、布劳特氏菌属等关键属来改变肠道微生物群组成。我们进一步发现纯化多糖（RKP）被鉴定为RK中的关键生物功能成分。我们目前的研究证明，RKP是2型糖尿病患者潜在的有效膳食补充剂。
亮点：
1. 红芸豆粗多糖具有抗糖尿病作用；
2. RK调节不饱和脂肪酸的生物合成，富集关键菌属；
3. 纯化多糖(RKP)被鉴定为其关键生物功能成分；
4. RKP可作为2型糖尿病患者的有效膳食补充剂。
论文ID
原名：Polysaccharides from Red Kidney Bean Alleviating Hyperglycemia and Hyperlipidemia in Type 2 Diabetic Rats via Gut Microbiota and lipid Metabolic Modulation
译名：红芸豆多糖通过调节肠道菌群和脂质代谢减轻2型糖尿病大鼠的高血糖和高血脂
期刊：Food Chemistry
IF：9.231
发表时间：2022.10
通讯作者：黄晓君
通讯作者单位：南昌大学食品科学与技术国家重点实验室
多糖提取方法：红芸豆是从当地超市购买的。将粗多糖完全溶解在蒸馏水中，并基于静态吸附试验，用JK008大孔树脂纯化溶液，以获得红芸豆（RKP）的纯多糖。中性糖含量通过苯酚-硫酸法测定。根据硫酸钡-巴唑法测定了尿酸含量。通过高效凝胶渗透色谱（HPGPC）法测定RKP的分子量（MW）。RKP的单糖组成通过高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测（HPAEC-PAD）测定
实验结果
1. RK对血糖稳态和血脂的影响
高血糖和高血脂是T2DM最常见的症状，因此改善糖稳态和脂质代谢对改善T2DM至关重要。本研究结果表明，与对照组大鼠相比，糖尿病大鼠的血清空腹血糖（FBG）、糖基化血清蛋白GSP、曲线下面积AUC、非酯化脂肪酸NEFA、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）显著升高（p<0.01）（图1A-H）。HDL-C的增加可能与HFD有关，在HFD条件下，大鼠需要更多的HDL-C来转运脂质。然而，低剂量RK（RKL）、中剂量RK（RKM）、高剂量RK（RKH）和二甲双胍可显著降低2型糖尿病大鼠血清GSP、NEFA、TC、TG、LDL-C水平（p<0.01）。给予RKL、RKM和二甲双胍4周可显著降低2型糖尿病大鼠的AUC水平（p<0.05）。虽然所有处理组（Met、RKL、RKM、RKH）在改变空腹血糖方面表现出不同的效率（1-4周）（图S1A），但只有RKM在最后一周显著降低了FBG水平（图1A）。RKM组大鼠体重明显高于糖尿病（DM）组（图S1B）。这些结果表明，补充RKM可有效改善2型糖尿病大鼠的葡萄糖稳态和血脂。
图1 RK对2型糖尿病大鼠葡萄糖稳态和血脂的影响
对（A）空腹血糖（FBG），（B）糖基化血清蛋白（GSP），（C）口服葡萄糖耐量试验（OGTT）曲线下面积（AUC），（D）非酯化脂肪酸（NEFA），（E）总胆固醇（TC），（F）甘油三酯（TG）、（G）高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和（H）低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）的影响。采用Tukey事后检验的单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较。*与CON组相比，p<0.05，**p<0.01；#与DM组相比，p<0.05，##p<0.01。
2. RK对胰岛素抵抗和胰腺病理的影响
血清胰岛素水平，HOMA-IR通常用于评估胰岛β细胞功能，以反映胰岛素抵抗的水平。如图2A、B、D所示，2型糖尿病大鼠表现为严重的囊泡变性、β细胞损伤、胰岛素抵抗（p<0.01）。给予RKL和RKM可减轻胰岛坏死和β细胞损伤。RKM使胰岛素浓度略有升高。此外，RKH可降低HOMA-IR水平。
我们进一步研究各组胰岛素受体(IR)、胰岛素受体底物1 (IRS-1)、胰岛素受体底物2 (IRS-2)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B (AKT)和葡萄糖转运蛋白2 (GLUT-2) mRNA表达水平(图S2)，建立基本生化指标与各组IR、IRS-1、IRS-2、PI3K、AKT、GLUT-2 mRNA表达水平的Spearman相关性(图2C)。结果表明，与DM组相比，RKM处理组IR、IRS-1、IRS-2、PI3K、GLUT-2的mRNA表达水平增加（图S2）。IR、IRS-1和AKT的mRNA表达水平与HOMA-IR呈显著负相关，而IRS-2、PI3K和GLUT-2与所有基本生化指标呈弱相关。这一结果可能表明，RK通过增加IR、IRS-1 mRNA的表达，轻微缓解了胰岛素抵抗。
图2 RK对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗和胰腺组织病理学的影响
RK对（A）胰岛素浓度、（B）胰岛素抵抗（HOMA-IR）的影响。（C）2型糖尿病大鼠胰岛素受体（IR）、胰岛素受体底物1（IRS-1）、胰岛素受体底物2（IRS-2）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）和葡萄糖转运蛋白2（GLUT-2）的mRNA表达水平与10项生化指标之间的Spearman相关性。R值由渐变色表示，其中蓝色和粉红色单元格分别表示正相关和负相关；*p<0.05，**p<0.01。（D）实验中胰腺的组织病理学特征。胰腺组织用H&E（200×）染色。采用Tukey事后检验的单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较。*与CON组相比，p<0.05，**p<0.01；#与DM组相比，p<0.05，##p<0.01。
3. RK对血清代谢谱的影响
我们进行PCA以显示不同组之间的代谢差异。PCA得分图显示，在正离子和负离子模式下，正常、糖尿病和RK处理样本之间存在明显差异。重要的是，RKM处理组的恢复效果最大（图3C-D），这表明RKM在T2DM中具有有效的缓解作用。
OPLS-DA分析用于研究整体代谢变化，并用于鉴别CON组和DM组之间投影变量重要性(VIP)大于1的重要代谢物 (图3A-B)。然后，我们使用显著代谢物（CON组和DM组之间的VIP>1，p<0.05和倍数变化（FC）>2）进行化学相似性富集分析（ChemRICH）。饱和溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、羟二十碳三烯酸（HETrE）、肉碱、胆酸、磷脂酰胆碱和饱和脂肪酸（FA）的簇增加，而T2DM患者的不饱和溶血磷脂酰胆碱簇减少。其他簇（饱和溶血磷脂、不饱和溶血血磷脂和不饱和脂肪酸）包含显著增加和减少的代谢物。11个簇与53个显著变化的代谢物相关（p<0.05），如图S3和表S2所示。为了进一步评估RK对2型糖尿病大鼠血清代谢物的调节，我们根据53种代谢物构建了维恩图和热图（图3E-G，表S2）。所有处理组（RKL、RKM、RKH、Met）均显著降低了11种代谢物（与DM组相比，p<0.05，VIP>1）（图3F）。粗多糖处理（RKL、RKM、RKH）显著降低了8种代谢物（与DM组相比，p<0.05，VIP>1）（图3G），包括LysoPC (15:0)、LysoPE (0:0/18:2 (9Z,12Z))、LysoPE (0:0/20:4 (5Z,8Z,11Z,14Z))、PA (p -16:0 /18:2 (9Z,12Z))、反油酸、Nonadeca-10 (Z) -烯酸、二十碳烯酸和二十二碳六烯酸。
图3 RK对2型糖尿病大鼠血清代谢组学的影响
（A）正离子模式下DM组和CON组之间的OPLS-DA得分图，（B）负离子模式下DM组和CON组之间的OPLS-DA得分图，（C）正离子模式下DM、CON、Met、RKL、RKM、RLH组的PCA评分图，（D）负离子模式下DM、CON、Met、RKL、RKM、RLH组的PCA评分图，（E）CON组、Met组、RKL组、RKM组和RKH组与DM组的维恩图比较（p<0.05，VIP>1），(F) RK和Met处理改善的显著代谢物热图，(G) RK处理改善的显著代谢物热图，（H）CON/DM通路分析汇总图（1-10代谢通路满足p<0.05或影响值>0.1的条件），（I）RK/DM通路分析汇总图（第1，2，5，6，9代谢途径满足p<0.05或影响值>0.1的条件）。
代谢途径分析显示重要代谢物在T2DM中起重要作用。如图3H-I所示，T2DM患者有七条通路（p<0.05或影响值>0.1）受到显著干扰，其中五条通路受RK处理的调节。这五条途径涉及不饱和脂肪酸的生物合成、亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化。不饱和脂肪酸的生物合成途径比RK调节的其他代谢途径最重要（图3I）。参与1-7代谢途径的关键差异代谢物（VIP>1，与DM组相比p<0.05 CON）的详细信息如图S4所示。
图4 RK对2型糖尿病大鼠肠道微生物群的影响及其与重要代谢产物的相关性
（A）不同大鼠组肠道细菌属水平的细菌分类学分析（每组n=6）。差异通过Mann–Whitney U检验进行评估。*与CON组相比，p<0.05，**p<0.01；#与DM组相比，p<0.05，##p<0.01。（B）19种重要代谢物的浓度与所有组中微生物属的相对丰度之间的Spearman相关性。R值由渐变色表示，其中蓝色和粉红色单元格分别表示正相关和负相关；*p<0.05，**p<0.01。
4. RK对肠道菌群的影响及其与重要代谢物的相关性
为了研究RK对2型糖尿病大鼠肠道微生物群的调节，我们通过16S rRNA基因的V4区分析结肠微生物群组成。图S5-6显示了基于不同处理组的未加权unifrac距离的α多样性指数和β多样性分析。为了分析微生物个体组成对RK干预的反应，我们进行了Mann–Whitney U检验，以测量处理组和DM组之间属水平的细菌丰度（图4A）。与DM组相比，RKM组的颤螺菌、粘螺旋菌的丰度明显降低，密螺旋体和拟杆菌、考拉杆菌、琥珀酸弧菌属、布劳特氏菌属的丰度显著增加（p<0.05）。RKL与四种细菌属的调节有关（包括粘螺旋菌的数量减少，拟杆菌、考拉杆菌和布劳特氏菌属的数量增加）。
为了研究重要变化代谢物与肠道微生物群的相关性，在所有组中，19种重要血清代谢物的浓度与微生物属的相对丰度之间建立了Spearman相关分析（图4B）。RKL、RKM或RKH减少的19种代谢物与拟杆菌的百分比呈负相关。L-棕榈酰肉碱、硬脂酰肉碱、Arachidyl carnitine、LysoPE (0:0/18:2 (9Z,12Z))、LysoPC(15:0)、LysoPC(16:0)、LysoPC(17:0)、LysoPE(0:0/16:0)、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸(24:5n-6)、PA (P-16:0e/18:2(9Z,12Z))与粘螺旋菌呈显著正相关。RKL、RKM或RKH减少的6种脂类代谢物（反式油酸、Nonadeca-10（Z）-烯酸、二十碳烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸（24:5n-6）、PA（P-16:0e/18:2（9Z，12Z））与考拉杆菌、琥珀酸弧菌属、布劳特氏菌属呈负相关。
图5 RKM和RKP对2型糖尿病大鼠血糖稳态和血脂的影响
对（A）空腹血糖（FBG）、（B）糖化血清蛋白（GSP）、（C）口服葡萄糖耐量试验（OGTT）曲线下葡萄糖面积（AUC）、（D）非酯化脂肪酸（NEFA）、（E）总胆固醇（TC）、（F）甘油三酯（TG）、（G）高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）和（H）低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的影响。（I）胰岛素浓度，（J）胰岛素抵抗（HOMA-IR）。采用Tukey事后检验的单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较。*与CON组相比，p<0.05，**p<0.01；#与DM组相比，p<0.05，##p<0.01。
5. RKP和RKM对葡萄糖稳态、血脂和胰岛素抵抗的影响
为了确定RK的主要功能性抗糖尿病成分，我们采用JK008树脂吸附技术纯化RK，获得RKP。如表S3和图S7所示，RKP由分子量为1322、30和0.7 kDa的多糖部分和由岩藻糖：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：半乳糖醛酸=4.41:30.28:20.54:25.26:16.34:3.15的单糖组成。我们分别测定了粗多糖（RKM）的最佳剂量和低、中、高剂量纯多糖（R KPL、RKPM、RKPH）对2型糖尿病大鼠葡萄糖稳态和血脂的影响（图5A-H）。与RKM、RKPL和RKPM相比，RKPH具有最好的降低高血糖和血脂作用。此外，只有RKPH显著减轻了胰岛素抵抗（图5I-J）。这些结果表明，RK的抗糖尿病作用可能主要由其纯多糖部分驱动。
图6 2型糖尿病大鼠肠道微生物群与10项生化指标之间的Spearman相关性
R值由渐变色表示，其中蓝色和粉红色单元格分别表示正相关和负相关；*p<0.05，**p<0.01。
讨论
虽然我们之前的研究表明，RK对2型糖尿病小鼠有降糖作用，但RK对二型糖尿病大鼠肠道微生物群和血清代谢的影响尚不清楚。本研究表明，RK可以通过调节肠道菌群和宿主代谢，减轻2型糖尿病大鼠的高血糖和高血脂。高剂量的纯化多糖（RKPH）比最佳剂量的粗多糖（KKM）具有更好的抗糖尿病作用，表明纯多糖是其抗糖尿病作用的主要生物活性成分。
血清代谢物已知会影响宿主新陈代谢，因此可以反映宿主的健康状况。RK处理改善了宿主的代谢途径，包括不饱和脂肪酸的生物合成、亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢以及戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化。五分之四的途径属于脂质代谢。许多前瞻性研究调查了脂质代谢产物与T2DM发病率之间的关系。饱和脂肪酸、酰基肉碱、部分不饱和脂肪酸和磷脂在HFD诱导的肥胖小鼠中升高。在我们的研究中，RK处理降低了磷脂酰乙醇胺(即，LysoPE (0:0/18:1 (11Z))、LysoPE (0:0/18:2 (9Z,12Z))、LysoPE (0:0/20:3 (11Z,14Z,17Z))、LysoPE (0:0/20:4 (5Z,8Z,11Z,14Z))、LysoPE (0:0/20:4 (5Z,8Z,11Z,14Z)))、饱和溶血磷脂酰胆碱(即，LysoPC (14:0)、LysoPC (15:0)、LysoPC (16:0)、LysoPC(17:0)、LysoPC(18:0))，饱和溶血磷脂(即，LysoPC(0:0/16:0))、不饱和FA(即，二十二碳六烯酸、二十碳烯酸、反式油酸、Nonadeca 10 (Z) -烯酸、二十四碳五烯酸(24:5n-6))、不饱和溶血磷脂(即PA (P-16:0e/18:2 (9Z,12Z))(图3E和S3)。
大量证据表明，肠道微生物群的变化与T2DM密切相关。几项研究表明，膳食多糖与肠道菌群组成之间存在相互作用。由于食用安全性和病理活性，膳食多糖通过重塑肠道细菌组成在抗糖尿病活性中发挥关键作用。拟杆菌作为人类肠道菌群中的一个主要属，具有广泛的生物功能，可以代谢各种类型的膳食多糖。多项研究表明，多糖可以增加拟杆菌的丰度（p<0.05）。我们的结果表明，RKL、RKM通过增加拟杆菌的丰度来调节糖尿病大鼠的肠道菌群。越来越多的证据表明，微生物组成可能影响宿主代谢，而Bacteroides plebeius的丰度与TC水平呈负相关。我们的数据清楚地表明，RK处理后拟杆菌属的增加与2型糖尿病大鼠体内特定代谢物的激增显著相关，例如饱和溶血磷脂酰胆碱、肉碱、磷脂酰乙醇胺和不饱和脂肪酸。我们还分析了所有组的2型糖尿病大鼠肠道微生物群与10项生化指标之间的相关性（图6）。值得注意的是，我们发现七个代谢参数，包括GSP、AUC、NEFA、TC、TG、HDL-C和LDL-C与肠道微生物群中拟杆菌丰度的变化显著负相关。这些结果表明，RKL、RKM处理后拟杆菌属数量的增加可能影响T2DM的缓解。
考拉杆菌作为一种天然的多糖发酵菌，与宿主的生理和代谢状态密切相关。最近的研究也表明，琥珀酸病毒与总脂肪摄入量呈负相关。先前的研究表明，低脂肪饮食可以增加布劳特氏菌属。此外，布劳特氏菌属的丰度与内脏脂肪面积和三种血脂标志物（TC、LDL-C、非HDL-C）显著负相关。更重要的是，据报道，小檗碱和二甲双胍在改善大鼠高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗过程中也会增加布劳特氏菌属。最近的证据表明，布劳特氏菌属丰度的增加与葡萄糖和脂质稳态的改善显著正相关。与上述证据相一致，本研究表明，RKM处理增加了考拉杆菌、琥珀酸弧菌、布劳特氏菌属的丰度。这三个属与二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、反油酸、Nonadeca-10（Z）-烯酸、四碳五烯醇酸（24:5n-6）呈显著负相关。值得注意的是，这五种代谢物都属于不饱和脂肪酸。因此，RKM处理组中考拉杆菌、琥珀酸弧菌、布劳特氏菌属的富集表明，RKM对肠道微生物群的诱导作用可能与不饱和脂肪酸的代谢途径有关。
结论
本研究中，我们发现从RK中分离出的400 mg/kg纯化多糖(1322、30和0.7 kDa)比最佳剂量的粗多糖(RKM)具有更好的抗糖尿病作用。鉴于纯多糖可能的抗糖尿病机制，各种研究为利用天然多糖通过靶向肠道微生物群来控制T2DM的发展提供了有力的证据。总之，本研究提供了证据支持RKP作为2型糖尿病患者的有效膳食补充剂。未来的研究应侧重于纯多糖对特定细菌属的影响，并明确了解多糖在改善脂质代谢过程中与有益细菌生长的构效关系。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814622025602
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