导读
这项研究旨在研究肠道生态失调在引发大脑炎症中的作用及其对阿尔茨海默氏病(AD)机理的影响。作者以年龄依赖的方式分析了3×Tg小鼠的肠道菌群组成，并用来自AD患者和年龄匹配的健康供体的粪便样本对无菌的3×Tg小鼠进行了粪菌移植。微生物16S rRNA测序显示拟杆菌富集。与无特定病原体的小鼠相比，作者发现无菌3×Tg小鼠的脑淀粉样蛋白-β斑块和神经原纤维缠结病理明显减少。海马RNA测序显示，在没有肠道菌群的情况下，3×Tg小鼠大脑中的炎症途径和胰岛素/IGF-1信号异常改变。通过代谢组学分析鉴定的多不饱和脂肪酸代谢物，其氧化酶选择性升高，与小胶质细胞活化和炎症相关。与移植健康个体的微生物群相比，移植AD患者的肠道微生物组加剧了3×Tg小鼠的AD病理，这与C/EBPβ/天冬酰胺内肽酶途径激活和认知功能障碍有关。这些发现表明复杂的肠道微生物群是行为异常、小胶质细胞激活和AD病理学所必需的，肠道微生物群影响AD模型小鼠中的病理学，并且人类微生物群的失调可能是AD的危险因素。
论文ID
原名：Gut microbiota regulate Alzheimer’s disease pathologies and cognitive disorders via PUFA-associated neuroinflammation
译名：肠道微生物通过多不饱和脂肪酸相关的神经炎症调节阿尔茨海默病的病理和认知障碍
期刊：Gut
IF：31.793
发表时间：2022.10
通讯作者：叶克强
通讯作者单位：埃默里大学&中国科学院深圳先进技术研究院脑认知与脑疾病研究所
实验结果
1. 肠道微生物影响3×Tg小鼠的AD病理、认知障碍和刺激小胶质细胞激活
本研究作者在先前报道了老年3×Tg小鼠的微生物群加速了年轻3×Tg小鼠的AD病理学，并激活大脑中的C/EBPβ/AEP信号传导，表明年龄依赖性微生物群变化会影响AD病理学。因此，微生物群组成的纵向研究对于发现影响宿主的微生物群落变化是必要的。为了在AD模型小鼠中鉴定促进生理或病理生理反应的微生物群中的时间特征，作者利用3×Tg AD模型小鼠，并通过高通量测序分析生成了17个月的16S rRNA基因谱时间序列。微生物组分析揭示了4、8、12和17个月大的3×Tg小鼠的微生物组成显着不平衡。此外，主坐标图(PCoA)表明，3×Tg小鼠的微生物群与年轻的野生型小鼠明显聚集在一起（补充图1A、B）。在门水平上，与4个月大的野生型小鼠相比，4、12和17个月大的3×Tg小鼠的变形菌门的相对丰度升高（补充图1 B-D）。另一方面，厚壁菌门和蓝菌门的相对丰度逐渐下降，而相比之下，与4个月大的3×Tg小鼠相比，8个月大和17个月大的3×Tg小鼠的拟杆菌门显着增加。厚壁菌门的减少和拟杆菌门的增加与炎症和不同疾病的增加有关。此外，粘蛋白降解和诱导炎症的瘤胃球菌属在年老的3×Tg小鼠中表现出相对丰度增加（补充图2 A-C）。简而言之，微生物组分析表明，年老的3×Tg小鼠的微生物群发生了改变，其特征是有益抗炎细菌群落减少，肠道促炎病原体增加（补充图1 C and G）。
为了研究肠道菌群在AD发病机制中的作用，作者采用了无菌3×Tg AD模型小鼠。无菌（GF）小鼠的平均体重比年龄相同的同窝无特定病原体（SPF）小鼠轻。此外，由于缺乏肠道微生物群，GF小鼠表现出盲肠增大，体重增加，盲肠内容物呈深色(补充图3A，B)，尽管它们的胃肠道长度与SPF小鼠的相当（补充图 3C、D）。来自GF小鼠粪便样本的无菌情况通过细菌培养得到进一步验证，细菌培养未显示出细菌（补充图 3E、F）。与SPF 3×Tg小鼠相比，GF小鼠皮质中沉积的Aβ聚集体和ThS（硫黄素 S）免疫荧光（IF）共染色信号显着降低。此外，与SPF小鼠相比，用特异性T22单克隆抗体验证的海马和纤维状tau包涵体中的过度磷酸化tau（AT8），在GF小鼠中大大减少（图1 A，B）。定量结果显示，与SPF小鼠相比，GF小鼠的Aβ42，而不是Aβ40，都有所减少（图1C）。这些结果表明，当肠道微生物群被移除时，AD病症会得到缓解。
尽管两种小鼠大脑中的BDNF（突触发生和树突分枝的重要神经营养因子）水平相似（补充图3G），但高尔基染色显示，与SPF小鼠相比，GF小鼠海马神经元中的树突棘高度升高（补充图3H,I）。同时，Y型迷宫中的行为实验显示，GF小鼠与SPF小鼠相比，空间记忆功能明显改善（图1D，E）。小胶质细胞的成熟和激活与AD大脑的慢性神经炎症有关。因此，Iba-1染色显示GF小鼠大脑皮层中的小胶质细胞的增殖过程明显延长，节段、分支和末端点的数量增加。小胶质细胞的半自动定量三维形态测量显示，与SPF小鼠相比，GF小鼠的这些小胶质细胞形态有明显变化（图1F-I）。因此，肠道微生物群促进了AD病症、认知障碍和小胶质细胞的激活。
图1 与SPF 3×Tg小鼠相比，无菌3×Tg小鼠表现出缓解的AD病理和改善的认知功能。(A)来自无菌3×Tg小鼠和SPF小鼠的大脑额叶皮层区域的Aβ(红色)和ThS(绿色)，大脑海马CA1区域的AT8(绿色)和T22(红色)的免疫荧光染色。比例尺:20 µm。(B)分别对Aβ阳性细胞、ThS阳性细胞、AT8阳性细胞和T22阳性细胞进行定量分析。SPF小鼠脑中Aβ、ThS、AT8和T22阳性细胞的密度显着增加。(每组n=5，数据显示为平均值±SEM。** P<0.01，**** p<0.0001与对照组相比，未配对T检验)。(C)使用人Aβ40和Aβ42 ELISA试剂盒测量无菌3×Tg小鼠和SPF 3×Tg小鼠皮质中的Aβ40和Aβ42浓度。与无菌3×Tg小鼠皮层相比，SPF 3×Tg小鼠皮层中Aβ42而不是aβ40的浓度显着增加。(每组n=5，与对照组相比，数据显示为平均值±SEM，*** p<0.001，多组未配对T检验)。(D，E) Y-迷宫行为实验。自发交替(%) (D)，进入臂的次数(E)；每组n=8，数据显示为平均值±SEM。* P<0.05，与对照组相比，未配对T检验。(F)皮质中Iba-1(红色)的免疫荧光染色的代表性图像(上图)和存在于无菌3×Tg小鼠和SPF 3×Tg小鼠皮质中的Iba-1染色小胶质细胞(下图)的3D重建。(G-I)对位于皮层中的小胶质细胞的直径、分支点数量和总分支长度进行定量分析。数据代表平均值±SEM；12个样本的代表数据；与对照组相比，*p<0.05，****p<0.0001，非配对T检验。Aβ，淀粉样蛋白-β；GF，无菌；SPF，无特定病原体。
2. 肠道微生物激活C/EBPβ/AEP通路，提高与多不饱和脂肪酸代谢有关的促炎酶
作者先前的研究表明C/EBPβ/AEP信号通路调节AD病理。为了研究肠道微生物群是否需要刺激该途径，从而促进AD发病，作者进行了免疫印迹分析，发现与SFP小鼠相比，GF 3×Tg小鼠的大脑中C/EBPβ/AEP信号减弱，AEP截断的tau N368和APP N585片段减少，磷酸化tau AT8和AT100的活性降低。值得注意的是，与SPF小鼠相比，GF 3×Tg小鼠的Lox5，Cox1和Cox2水平明显降低(图2A，B)，这与先前的发现相符，即花生四烯酸（AA）代谢途径不仅是炎症的核心网络，也是工作记忆障碍导致AD发病的主要原因。蛋白酶分析显示，GF小鼠中的AEP酶活性低于SPF小鼠，与AEP活性降低一致(图2C)。由于C/EBPβ是IL-6的主要转录因子，因此，与SPF小鼠相比，GF小鼠中的IL-6浓度显著降低(图2D)。qRT-PCR显示，与SPF小鼠相比，GF小鼠的CEBPβ靶点/AA通路基因略有减少（图2E），与RNAseq数据相对应。然而，qRT-PCR数据没有统计学意义，这可能是由于定量PCR（qPCR）分析数据的个体间差异较大。
大脑切片的IF共染色结果显示，GF小鼠与SPF小鼠相比，海马和大脑皮层的C/EBPβ上调、AEP激活、Aβ积累、Tau N368碎片和磷酸化Tau（AT8）减少（补充图4A-D，海马：A和D；大脑皮层：B和C），与GF小鼠中C/EBPβ/AEP信号的减少和APP N585和Tau N368碎片的减弱一致。此外，GF小鼠大脑中5-Lox、Cox1和Cox2的活性明显降低，这与C/EBPβ信号的减少密切相关（补充图4E-H，皮质：E、F和G）。因此，GF小鼠与SPF小鼠相比，C/EBPβ/AEP信号和与AA相关的炎症酶减少了，这表明肠道微生物群通过激活C/EBPβ/AEP途径调节这些效应物的表达。免疫组化（IHC）染色进一步证实，与SPF小鼠相比，GF小鼠大脑中的Iba-1和AEP都减少了（补充图4I），这与Iba1和AEP在大脑皮层中的IF共染结果一致。因此，GF 3×Tg小鼠表现出C/EBPβ/AEP途径的下调和AA相关的炎症。
图2 无菌(GF) 3×Tg小鼠表现出C/EBPβ/AEP通路下调和AA相关炎症。(A) 免疫印迹显示无菌3×Tg小鼠和SPF 3×Tg小鼠小鼠大脑中的磷酸化C/EBPβ、AEP、APP和tau的表达，以及花生四烯酸代谢。(B) 免疫印迹的定量分析。用image J测量活性AEP、Tau N368、APP N585、C/EBPβ、LOX5、Cox1、COX2、BLT1和BLT2的条带，并以β-actin蛋白为标准。每组n=5，数据显示为平均值±SEM，* p<0.05，** p<0.01,与对照组相比，未配对t检验。(C) 来自无菌3×Tg小鼠和SPF 3×Tg小鼠的脑裂解液中的AEP活性测定。与无菌3×Tg小鼠相比，SPF 3×Tg小鼠的AEP活性呈上升趋势。数据代表平均值±SEM；五个样本的代表性数据；** p<0.01，与对照组相比，未配对t检验。(D)无菌3×Tg小鼠和SPF 3×Tg小鼠的脑裂解液中促炎症细胞因子IL1-β、IL-6和TNFα的浓度。数据代表平均值±SEM；五个样本的代表数据；***p<0.001，与对照组相比，多重非配对t检验。(E) 对GF小鼠与SPF小鼠的大脑样本进行定量RT-PCR分析，比较C/EBPb靶向AA通路基因。AA，花生四烯酸；AEP，天冬酰胺内肽酶；COX，环氧化酶；SPF，无特定病原体。
3. 肠道微生物增加了炎症代谢产物，改变了大脑中的炎症和胰岛素/IGF-1途径
为了研究肠道微生物群对AD相关转录反应的整体影响，作者使用GF和SPF 3×Tg小鼠的海马样本进行了无偏RNA测序，并通过RNA转录产物的定量深度测序来测量全基因组的mRNA表达谱（图3和补充图5A,B）。作者发现SPF和GF小鼠之间的mRNA谱和整体基因表达模式存在明显差异。通过主成分分析（PCA）评估数据集的主要变异来源，发现GF和SPF 3×Tg小鼠之间有很强的分离（图3A）。与GF 3×Tg小鼠相比，SPF 3×Tg小鼠中含有1872个差异基因（图3B）。在差异表达的基因中，SPF 3×Tg小鼠的海马中脂蛋白E的表达相比于GF 3×Tg小鼠有所下降。接下来，作者通过功能mRNAs的聚类分析将GF和SPF 3×Tg小鼠海马之间差异表达的基因生成热图（图3C）。结果发现，参与AA代谢途径的基因，包括Hpgd、Ptges3、Ptges2和Cyp1b1，在SPF 3×Tg小鼠中表达不同，与GF 3×Tg小鼠相比（上调：Hpgd、Ptges3和Cyp1b1；下调：Ptges2）（图3D），与之前观察到的许多AA相关的炎症酶在GF小鼠中明显减少相一致。除了AA代谢途径中的促炎症基因发生了显著的变化外，RNA测序结果显示，与GF小鼠相比，SPF小鼠的胰岛素信号及其相关的下游途径发生了异常的改变（图3E）。因此，作者通过免疫印迹法研究了海马的胰岛素信号传导，发现与SPF小鼠相比，GF小鼠的磷酸化胰岛素受体（IR）和磷酸化IRS（IR底物）及其下游效应子，包括p-Akt和p-MAPK以及p-GSK活性都显著增加（图3F）。这些数据与以前的报告一致，即AD患者表现出大脑胰岛素抵抗和胰岛素缺乏。
接下来，作者使用公共基因数据库（GO、KEGG和PANTHER）对海马区差异表达基因进行了富集分析（补充图5C,D），并确定了参与细胞凋亡、血清素和多巴胺、GABA能神经元、谷氨酸和去甲肾上腺素途径的基因的改变（补充图5E-I）。如图所示，SPF小鼠中包括Tnf、Apaf1、Fasl等在内的促凋亡基因表达增加，而抗凋亡基因Bcl2l1表达减少，尽管包括Bax、Bad、Casp3等在内的促凋亡基因在SPF小鼠中也减少，表明不同途径介导的细胞凋亡效应子在SPF和GF小鼠中发生了很大变化，GF 3×Tg小鼠大脑中的细胞可能对凋亡有更强的抗性（补充图5E）。编码转运神经递质5-羟色胺的整体膜蛋白的Slc6a4基因在SPF小鼠中表达减少，编码5-羟色胺受体的Htr3b、Htr4基因在SPF小鼠中也减少，表明GF小鼠海马中的5-羟色胺信号传导可能增加（补充图5F）。Ankk1基因与Drd2基因密切相关，两者在SPF小鼠中都有所下降，而编码多巴胺受体的Drd2、Drd3、Drd4和Drd5在SPF小鼠中也有所下降，这表明在GF小鼠中表达的多巴胺受体更多（补充图5F）。Gad1编码谷氨酸脱羧酶，负责催化从L-谷氨酸产生γ-氨基丁酸（GABA）；Aldh9a1基因编码将γ-氨基丁醛氧化为GABA的酶；Gabarap基因编码GABA（A）受体相关的蛋白。所有这些基因在SPF小鼠中都减少了，而编码负责GABA分解代谢的4-氨基丁酸氨基转移酶的Abat基因在SPF小鼠中增加了，表明与SPF小鼠相比，更多的GABA在GF 3×Tg小鼠海马中合成而没有降解，更多的GABA受体在GF小鼠中合成（补充图5G）。Gls和Gls2基因编码谷氨酰胺酶，催化谷氨酰胺水解为谷氨酸和氨。Glul基因编码从谷氨酸合成谷氨酰胺的蛋白质；Grin1、Grin2a、Grin2b基因编码N-甲基-D-天门冬氨酸受体的亚基。与SPF小鼠相比，上述所有基因在SPF 3×Tg小鼠的海马中都有所增加，而GF小鼠大脑中产生的谷氨酸较少，同时伴随着较高的谷氨酸降解和较少的谷氨酸受体合成（补充图5H和7H）。Comt基因编码儿茶酚-O-甲基转移酶；Dbh基因编码催化多巴胺转化为去甲肾上腺素的氧化还原酶，它们在SPF小鼠与GF小鼠中都有所下降，而编码α-1A-肾上腺素能和α-2A-肾上腺素能受体的Adra1a和Adra2a基因在SPF小鼠中有所增加，表明GF小鼠大脑中去甲肾上腺素的产生较少（补充图5I）。作者通过qRT-PCR验证了每个途径的两个关键基因，结果与RNA测序的发现一致（补充图5J）。NeuN和TUNEL共染色结果显示，SPF小鼠海马神经元的凋亡大大增加（补充图5K）。总之，这些数据表明，常驻肠道的微生物群影响了GF和SPF 3×Tg AD模型小鼠的海马区mRNA表达的转录组。
图3 肠道微生物群影响无菌和SPF 3×Tg AD模型小鼠海马区mRNA表达的转录组图谱。(A)在主成分分析（PCA）中显示样本与样本之间的距离。(B)散点图显示log2（倍数变化）与标准化的平均基因数。(C)GF和SPF中功能性mRNAs的聚类分析，数据以热图表示（P<0.05）。每一行代表单个基因在所有小鼠中的相对表达水平；每一列代表单个小鼠的表达水平。红色和绿色分别表示低表达和高表达。(D）热图显示GF和SPF之间花生四烯酸代谢途径的差异基因。(E)差异基因的KEGG和Panther通路分析。(F)免疫印迹显示无菌3×Tg小鼠和SPF 3×Tg小鼠海马中的胰岛素/IGF-1信号通路。(G)免疫印迹的定量分析。用image J测量p-IR、p-IRS和p-GSK的条带，并分别用IR、IRS和GSK进行归一化。每组N=5，数据显示为平均值±SEM，**p<0.01，与对照组相比，未配对t检验。AD，阿尔茨海默氏病；GF，无菌；IR，胰岛素受体；SPF，无特定病原体。
4. 短链脂肪酸引发GF 3×Tg小鼠的C/EBPβ/AEP通路激活、认知缺陷和炎症，并由前列腺素E2-1-甘油酯加剧
AD患者的肠道微生物群含有较低比例的产丁酸盐的主要物种，如丁酸弧菌属和尤氏菌属的成员。与没有痴呆症的健康老人相比，AD老人还显示出丁酸盐酶编码基因的减少。产丁酸盐的物种比例降低会导致炎症状态。事实上，短链脂肪酸（SCFAs）在AD患者的粪便和移植前GF小鼠的血清中减少了（补充图11）。为了研究SCFAs是否会部分模拟SPF小鼠定植的肠道微生物群以触发C/EBPβ/AEP通路的激活，作者给GF 3×Tg小鼠喂食乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的混合物（而动物保持无菌）连续3个月。免疫印迹显示，在喂食SCFAs的GF小鼠中，p-C/EBPβ及其总蛋白水平上升；因此，下游的AEP及其活性增加，这引发了Tau N368和APP N585的增强。随后，p-Tau AT8活性也相应提高。因此，与对照组相比，C/EBPβ的下游目标，包括Lox-5、Cox1、Cox2、BLT1和BLT2的水平在SCFA喂养中得到提高（图4A）。定量酶测定证实，与对照组相比，SCFA喂养的GF小鼠的AEP蛋白酶活性明显增强（图4B）。与C/EBPβ的激活一致，下游反应性炎症细胞因子IL-6增加（图4C）。Aβ的ELISA定量显示，Aβ42而不是Aβ40在大脑中的浓度因SCFA处理而明显增加（图4D）。这些发现通过IF染色得到了进一步证实。在海马中，ThS阳性的Aβ聚集物和p-Tau AT8及纤维状Tau T22信号因SCFAs处理而增强（图4E,F）。此外，与AEP截断的Tau N368和APP C586片段相关的AEP升高也在SCFAs处理中被富集（补充图6A-F）。与SCFAs在GF 3×Tg小鼠中引起的AD病理一致，认知行为测试表明，在SCFA喂养的GF小鼠中，尽管进入臂次数保持不变，但自发交替百分比降低(图4G，H)。小胶质细胞是大脑的常驻巨噬细胞，可保护中枢神经系统免受伤害和感染。小胶质细胞还通过调节突触传递、突触形成和修剪以及胚胎期大脑形成等方面对整个胚胎期和成年期的大脑发育作出贡献。在受影响的海马和皮层区域，与对照处理的GF小鼠相比，SCFA喂养的GF小鼠的小胶质细胞表现出活化和成熟度形态的增加，并分别类似于来自GF和SPF小鼠的小胶质细胞（图4J，第一和第三面板）。
对脑组织样本的代谢组学研究，可以帮助人们直接了解AD发病机制的分子基础。因此，作者对GF和SPF 3×Tg小鼠的大脑样本进行了代谢组学分析。代谢组学结果显示，GF 3×Tg小鼠与SPF小鼠相比，大脑中与AA有关的代谢物减少（补充图7）。与SPF小鼠相比，GF小鼠粪便中的PUFA代谢物明显减少（图4I）。因此，作者选择了PGE2-G，一种从代谢组学中发现的来自PGE2的甘油共轭代谢物。在GF小鼠中，与对照处理相比，PGE2-G处理没有引起未成熟小胶质细胞的激活。然而，SCFA和PGE2-G的共同处理，可额外刺激GF小鼠的小胶质细胞形态成熟和激活（图4J-L），表明PGE2可刺激成熟而非未成熟的小胶质细胞激活。这些发现共同支持了SCFAs引发C/EBPβ/AEP的激活和GF 3×Tg小鼠的认知缺陷和炎症，并由花生四烯酸代谢物PGE2-G加剧。
图4 SCFAs引发GF 3×Tg小鼠的C/EBPβ/AEP通路激活、认知缺陷和炎症，并由PGE2-G加剧。(A）免疫印迹显示p-C/EBPβ、C/EBPβ、AEP、APP和tau的表达，以及给予或不给予SCFAs的GF小鼠大脑中花生四烯酸代谢情况。(B)给予或不给予SCFAs的GF 3×Tg小鼠的脑裂解物AEP活性测定。SCFAs处理提高了GF 3×Tg小鼠大脑中的AEP活性。数据代表平均值±SEM；四个样本的代表数据；*p<0.05，与对照组相比，未配对t检验。(C)GF 3×Tg小鼠和SPF 3×Tg小鼠的脑裂解液中促炎症细胞因子IL1-β、IL-6和TNFα的浓度。数据代表平均值±SEM；四个样本的代表数据；*p<0.05，与对照组相比，多重未配对T检验。(D)使用人Aβ40和Aβ42ELISA试剂盒测定给予或不给予SCFAs的GF 3×Tg小鼠皮层中的Aβ40和Aβ42的浓度。与对照处理的GF 3×Tg小鼠相比，SCFAs处理的GF 3×Tg小鼠大脑皮层中的Aβ42而非Aβ40的浓度明显增加。(每组N=4，数据显示为平均值±SEM *p<0.05，与对照组相比，多重未配对T检验）。(E)在给予或不给予SCFAs的GF 3×Tg小鼠大脑的海马CA1区，Aβ（红色）和ThS（绿色）、AT8（绿色）和T22（红色）的免疫荧光染色。比例尺：20µm（F）分别对Aβ阳性细胞、ThS阳性细胞、AT8阳性细胞和T22阳性细胞进行定量分析。在SCFAs处理的GF 3×Tg小鼠大脑中，Aβ、ThS、AT8和T22阳性细胞的密度明显增加。(每组n=8，数据显示为平均值±SEM。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****p<0.0001，未配对T检验）。(G, H)Y型迷宫行为测试。自发交替（%）（G），进入臂的次数（H）；（每组N=9，数据显示为平均值±SEM。与对照组相比，***P<0.001，未配对T检验）。(I）GF小鼠和SPF小鼠粪便中花生四烯酸及其代谢物的浓度。(每组N=3，数据显示为平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比，多重未配对T检验）。(J) GF 3×Tg小鼠皮质中Iba-1（红色）的免疫荧光染色（上图）和Iba-1染色小胶质细胞（下图）的3D重建的代表性图像，用PGE2-G或SCFA处理的GF 3×Tg小鼠，用SCFA和PGE2-G处理的GF 3×Tg小鼠。(K, L) 定量分析位于皮层的小胶质细胞的直径、分支点数量。数据代表平均值±SEM；12个样本的代表数据；与对照组相比，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，多重未配对T检验；与对照组相比，#P<0.05，##P<0.01，##P<0.001，####P<0.0001，多重未配对T检验。Aβ，淀粉样蛋白-β；AEP，天冬酰胺内肽酶；GF，无菌；PGE2-G，前列腺素E2-1-甘油酯；SCFA，短链脂肪酸。
5. 与PUFA代谢有关的拟杆菌在移植AD微生物的GF小鼠中升高
由于AD患者微生物组发生了改变，作者又试图确定人类的肠道微生物组在转移到GF小鼠体内时是否影响疾病的结果。作者将三个患有AD疾病的人类和三个健康对照捐赠者的粪便样本通过口服灌胃接种到GF小鼠体内。从小鼠身上收集粪便颗粒，提取细菌DNA，并进行16S rRNA测序。微生物组分析显示，通过粪便微生物移植（FMT）在GF小鼠中建立了人类肠道微生物组。在门类水平上，分类学分析表明FMT受体小鼠的微生物群落与人类供体的微生物门类非常相似（图5A）。正如以前的一些研究结果，受体小鼠成功地携带了供体接种物中100%的门级和86%的属级分类群。此外，β多样性分析PCoA显示，FMT受体小鼠的微生物群与人类供体的微生物群聚集在一起（图5B），且供体和FMT受体小鼠之间的α多样性没有明显改变。因此，本研究数据表明人类肠道微生物群在GF小鼠中的成功移植。此外，肠拟杆菌（图5C）、脆弱拟杆菌（图5D）和Bacteroides xylanisolvens（图5E）的平均相对丰度显著上升，而Parabacteroides goldsteinii（图5F）、卵形拟杆菌（图5G）和梭状芽孢杆菌（图5H）的平均相对丰度明显下降。对FMT受体GF小鼠中增加的三株细菌（肠拟杆菌、脆弱拟杆菌和Bacteroides xylanisolvens）的培养液中花生四烯酸（AA）及其代谢物的浓度进行定量分析，表明这些细菌参与AA代谢并能产生AA代谢物（图5I）。
图5 移植人类粪便3×Tg小鼠粪便中的微生物组分析，揭示了接种AD患者粪便的无菌小鼠粪便中拟杆菌升高。(A)通过高通量测序分析确定的细菌门类的相对丰度。(B)微生物群落结构的主坐标图（PcoA）。(C-H)细菌种类的平均丰度。数据代表平均值±SEM；*p<0.05，与对照组相比，单因素方差分析。(I）花生四烯酸（AA）及其代谢物在肠拟杆菌、脆弱拟杆菌和木糖醇拟杆菌体外培养的培养基中的浓度。数据代表平均值±SEM；三个样本的代表数据；与对照组相比，**p<0.01，****p<0.0001，单因素方差分析。AD，阿尔茨海默氏病；ANOVA，方差分析。
6. AD患者肠道菌群增强AD病理并促进认知障碍
为了研究人类AD患者粪便样本是否能加速GF小鼠的AD病变，作者进行了IF染色，发现与健康对照相比，ThS阳性的Aβ聚集物在移植AD患者粪便3×Tg AD小鼠大脑中明显升高。此外，海马中的AT8/T22共染色也表现出类似的结果（图6A,B），支持AD患者的微生物群促进AD小鼠病变，包括老年斑和NFT。定量分析显示，在接种了AD患者粪便的GF小鼠中，Aβ42而不是Aβ40的浓度大幅增加（图6C）。IF共染色显示，与HC相比，C/EBPβ和AEP在AD粪便接种的GF小鼠中明显升高，Tau N368、APP C586和Aβ都大大增加，Iba-1和CD86染色信号结果表明小胶质细胞激活（补充图8A-E，H）。与AA代谢酶、LKB4和12-HHT受体的上调一致，C/EBPβ40的两个下游转录靶点BLT1和BLT2也在移植人类AD微生物的GF小鼠中明显上调（补充图8F-H）。与AD病理特征一致，免疫印迹法分析显示，在移植AD粪便的GF小鼠中，包括PSD95、GluR2和Spinophilin在内的突触蛋白与HC相比均有所下降（补充图9A）。与这些发现相一致，BDNF水平在移植AD粪便小鼠中明显降低（补充图9B）。同时，海马神经元的树突棘大大减少（补充图9C,D）。因此，与HC小鼠相比，移植AD粪便小鼠在Y型迷宫中表现出认知障碍，尽管进入的臂数之和没有统计学上的变化。然而，一对接种了AD与HC粪便样本的小鼠表现出明显的入臂数减少（图6D-G）。Iba-1染色和三维小胶质细胞重建分析表明，接种AD患者粪便的GF小鼠的小胶质细胞高度活化，形态成熟（图6H-K）。因此，这些数据表明AD患者和HCs之间的粪便微生物群落的差异可能在接种到GF小鼠后保持。
图6 移植AD患者粪便无菌（GF）小鼠表现出促进AD病理和认知障碍。(A）移植健康人群粪便GF 3×Tg小鼠和移植AD患者粪便GF 3×Tg小鼠大脑额叶皮层区域的Aβ（红色）和ThS（绿色）、海马CA1区域的AT8（绿色）和T22（红色）的免疫荧光染色。HC，用健康人群的粪便微生物组定植的GF小鼠；AD，用AD患者的粪便微生物组定植的GF小鼠。比例尺：20 µm（B）分别对Aβ阳性细胞、ThS阳性细胞、AT8阳性细胞和T22阳性细胞进行定量分析。Aβ、ThS、AT8和T22阳性细胞的密度在移植AD患者粪便GF 3×Tg小鼠脑中明显增加。(每组N=5，数据显示为平均值±SEM **p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001与对照组相比，未配对T检验）。(C)使用人Aβ40和Aβ42 ELISA试剂盒测量移植健康人群粪便GF 3×Tg小鼠和移植AD患者粪便GF 3×Tg小鼠皮质中的Aβ40和Aβ42浓度。与移植健康人群粪便GF 3×Tg小鼠皮层相比，移植AD患者粪便GF 3×Tg小鼠皮层中的Aβ42而非Aβ40的浓度明显增加。(每组N=5，数据显示为平均值±SEM，***p<0.001，与对照组相比，多重未配对T检验）。(D-G)Y型迷宫行为测试。(D-E）每个Y型迷宫测试中所有独立队列的汇总：自发交替（％），进入臂的次数，按粪便捐赠者的健康状况分组（每组23-24人，数据显示为平均值±SEM。与对照组相比，* P<0.05，未配对t检验）；（F-G）自发交替（%），移植来自AD患者或对应的HCs的微生物群的小鼠进入臂的次数。(每组N=7-8，数据显示为平均值±SEM，*p<0.05，与对照组相比，未配对t检验）。(H）皮层中Iba-1（红色）的免疫荧光染色的代表图像（上图）和Iba-1染色的小胶质细胞（下图）在移植健康人群粪便GF 3×Tg小鼠和移植AD患者粪便GF 3×Tg小鼠的大脑皮层中的三维重建。(I-K）位于皮层的小胶质细胞的直径、分支点数量和总分支长度的定量分析。数据代表平均值±SEM；12个样本的代表数据；与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，未配对t检验。Aβ，淀粉样蛋白-β；AD，阿尔茨海默氏病；HC，健康对照。
7. 移植AD患者粪便GF小鼠表现出C/EBPβ/AEP通路激活和促进炎症
为了深入了解移植AD患者粪便GF 3×Tg小鼠的病理情况，作者进行了免疫印迹分析，发现与健康对照组相比，移植AD患者粪便后p-C/EBPβ及其总蛋白水平明显升高。下游的AEP及其成熟形式也随着上游转录因子的变化而变化。因此，Tau N368和APP N585以及p-Tau AT8信号明显升高。同样，下游反应基因包括Lox-5、Cox1、Cox2、BLT1和BLT2水平都与上游C/EBPβ信号变化一致（图7A,B）。AEP的酶活性也得到了增强（图7C）。qRT-PCR显示，ALOX-5 mRNA的浓度比其他AA代谢相关基因的浓度高（图7E），表明ALOX5启动子可能对上游转录因子C/EBPβ的变化更加敏感。这些结果与AA代谢物在移植AD患者粪便GF小鼠中增加相关（补充图11）。
PCA分析表明，在HC组和移植AD患者粪便GF组以及GF组和SPF组内存在代谢差异（补充图10A-C）。值得注意的是，与移植健康人群粪便GF小鼠相比，移植AD患者粪便GF小鼠的粪便和血清样品的代谢组学特征明显不同。虽然与GF小鼠相比，SPF小鼠的大脑代谢组谱出现了明显的不同，但与移植健康人群粪便大脑相比，移植AD患者粪便GF的代谢差异很小。在粪便数据集中，与移植健康人群粪便GF组相比，移植AD患者粪便组的几种芳香族代谢物明显升高或有升高的趋势（不显著），而次级胆汁酸（如牛磺石胆酸盐 3-硫酸盐）、维生素（如硫胺素一磷酸盐）和苯甲酸盐代谢物（如苯甲酸盐）明显改变或有改变的趋势（不显著）（补充图10D）。在血清中，几个芳香族氨基酸代谢物（如：苯丙酮酸、多巴胺3-O-硫酸盐和3-吲哚硫酸盐）、次级胆汁酸（如：牛黄猪去氧胆酸）、维生素（如：吡哆醛）和苯甲酸盐（如：4-乙基苯基硫酸盐）代谢物在移植AD患者粪便GF组比移植健康人群粪便GF组明显高（补充图10E）。此外，在大脑中，多巴胺呈下降趋势，而苯甲酸盐代谢物马尿酸盐和儿茶酚硫酸盐与移植健康人群粪便GF组相比，在移植AD患者粪便GF小鼠中分别呈明显上升或上升趋势（补充图10F）。粪便中的几个戊糖代谢物在移植AD患者粪便GF组中明显更高（补充图10G）。在血清中，糖酵解代谢物丙酮酸含量明显较高，而戊糖、TCA循环和NAD代谢物在移植AD患者粪便和移植健康人群粪便GF组中显示出与粪便相似的结果（补充图10H）。TCA能量代谢物乌头酸和苹果酸在移植AD患者粪便GF组的大脑中明显更高（补充图10I）。在脂质代谢方面，移植AD患者粪便GF组的粪便中磷脂酰乙醇胺（PE）代谢物和1-硬脂酰-2-亚油酰-GPE含量更高（补充图11A）。几种LCFAs（长链脂肪酸，如肉豆蔻酸和二十二碳五烯酸）以及几种肉碱结合的脂肪酸在移植AD患者粪便GF组的血清中显著降低（补充图11B）。粪便和血清中的SCFAs，特别是丁酸盐，都有所减少（补充图11A,B）。在大脑中，与HC组相比，移植AD患者粪便GF组的鞘磷脂相关代谢物明显增加（补充图11C）。血清和大脑中与AA相关的代谢物，包括血栓素B2、PGF2α和12-HHTrE等，都有所增加，但不明显。这些数据表明，与移植健康人群粪便GF组相比，移植AD患者粪便GF组的脂质代谢发生了明显改变。精氨酸有助于细胞代谢、炎症信号传导和能量代谢。AD患者的精氨酸代谢发生了改变。在粪便、血清和大脑数据集中，与HC组相比，移植AD患者粪便GF组的几种精氨酸代谢物明显更高（补充图11D-F）。
免疫印迹分析表明，与年龄匹配的对照组大脑相比，人类AD患者大脑中的Lox5、Cox1、Cox2、BLT1和BLT2水平更高（补充图12A,B），与移植AD患者粪便GF小鼠血清和大脑中的AA代谢物升高相一致。IF染色进一步表明，与对照组相比，C/EBPβ和Lox5在AD人类大脑中Iba-1阳性的小胶质细胞和NeuN阳性的神经元中增加。此外，AD人类大脑中C/EBPβ的明显增强伴随着Lox5和AEP信号的增强，这是两个下游的转录靶标（补充图12C,D）。因此，AD患者的微生物组在移植的GF小鼠中促进了AD病理学和AA代谢酶，与炎症性小胶质细胞激活有关。
图7 移植AD患者粪便GF小鼠显示C/EBPβ/AEP激活和炎症升高。(A）免疫印迹显示移植健康人群粪便GF 3×Tg小鼠和移植AD患者粪便GF 3×Tg小鼠大脑中p-C/EBP β、C/EBP β、AEP、APP和tau的表达，以及花生四烯酸代谢。每组的四个样品来自两个单独的捐赠者（每个捐赠者2个样品）。(B）免疫印迹的定量分析。用Image J测量C/EBPβ、LOX5、COX1、COX2、BLT1和BLT2的条带，并以β-actin为标准。（每组N=4，数据显示为平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比，未配对t检验）。(C)移植健康人群粪便GF 3×Tg小鼠和移植AD患者粪便GF 3×Tg小鼠的脑裂解物中的AEP活性测定。与移植健康人群粪便GF 3×Tg小鼠相比，移植AD患者粪便GF 3×Tg小鼠的AEP活性出现了增加。数据代表平均值±SEM；五个样本的代表数据；*p<0.05，与对照组相比，未配对t检验。(D）促炎症细胞因子IL1-β、IL-6和TNFα分别在移植健康人群粪便GF 3×Tg小鼠和移植AD患者粪便GF 3×Tg小鼠的脑裂解物中的浓度。数据代表平均值±SEM；五个样本的代表数据；*p<0.05。与对照组相比，多重未配对t检验。(E）涉及花生四烯酸代谢的基因在移植健康人群粪便GF 3×Tg小鼠和移植AD患者粪便GF 3×Tg小鼠的大脑中的相对mRNA水平。数据代表平均值±SEM；三个样本的代表数据，*p<0.05，与对照组相比，双向方差分析。AD，阿尔茨海默病；AEP，天冬酰胺内肽酶；ANOVA，方差分析；COX，环氧化酶；GF，无菌；HC，健康对照。
讨论
肠道微生物群在各种神经系统疾病的外周以及中枢免疫激活和炎症中起着重要作用。在本研究中，肠道微生物群是AD模型小鼠中AD病理和认知障碍的必要条件。与SPF小鼠相比，无菌3×Tg小鼠表现出小胶质细胞活化、老年斑和NFT以及空间记忆障碍减少。RNA测序显示，与GF 3×Tg小鼠大脑相比，SPF小鼠大脑中胰岛素信号异常改变，促炎症的途径被上调。此外，移植人体菌群的GF小鼠大脑、血清和粪便的代谢组学分析表明，促炎症信号的增加和许多与AA有关的代谢物以及SCFAs的减少有关。在SCFAs存在的情况下，用PGE2-G（一种来自拟杆菌株代谢花生四烯酸的产物）治疗GF小鼠，可恢复AD病症和小胶质细胞的激活。这一发现提供了一个由肠-脑轴驱动的潜在分子机制。与健康对照相比，移植了AD患者微生物群的小鼠的空间记忆受损，这表明Aβ和Tau的过度表达与菌群失调相互作用，调节了疾病的进展。这些临床前的发现可能适用于人类，基因-微生物组的相互作用可能提供对AD发病机制的见解。
C/EBPβ是神经炎症中基因表达调节的一个关键因子，作者发现它在SPF或AD患者粪便移植小鼠大脑的小胶质细胞中被激活，并使涉及AA代谢的主要酶的mRNA转录增加（图2和7，（补充图4和补充图8）。这些发现与以前的研究一致，即COXs和LOX5以及PTGES的表达是由C/EBPβ介导的。Ptges3编码细胞质前列腺素E合成酶（cPGES）、Pgtes2编码微粒体PGES-2（mPGES-2），cPGES和mPGES-2都是将PGH2转化为PGE2的重要PGES。cPGES优先与COX-1配合，将PGH2转化为PGE2，而mPGES-2可以与COX-1和COX-2耦合，产生PGE2以响应炎症。GF小鼠的炎症和PGE2的减少与Hpgd和PGTES3 mRNA水平的降低相一致。而mPGES-2在组织中是组成性表达的，在组织炎症或损伤期间没有明显的增加。据推测，由于PGE2水平在GF小鼠中较低，PGGES2可能作为一种反馈补偿而增加（图3D）。Alox12基因编码的酶及其反应产物调节血小板功能。在来自人类糖尿病患者的胰岛中已经发现该基因的表达升高，但它在大脑中的作用还不清楚。因此，它是否由C/EBPβ介导仍未知。酶的升高导致各种AA代谢物的上调，包括PGE2、血栓素B2、LKB4和12-HHT等，这些代谢物的升高刺激了小胶质细胞的激活，进一步增加了神经炎症。此外，C/EBPβ调节胶质细胞激活中的许多促炎症基因。与这些发现一致，PGE2-G和SCFA处理引起GF 3×Tg小鼠小胶质细胞的明显激活和AD病变（图4）。因此，C/EBPβ和介导促炎性AA代谢的酶之间存在着恶性循环，以促进神经炎症。除胶质细胞外，C/EBPβ在神经元中也是一个关键的转录因子，调节主要的AD效应因子的表达，包括APP、MAPT和AEP等。作者先前报道了C/EBPβ/AEP信号在神经元中随年龄增长而增加，增强的APP和Tau蛋白随后被活性AEP所裂解，引发了AD的发病机制。C/EBPβ的缺失能在缺血或兴奋性损伤后提供神经保护，这两种模型中抑制COX-2是有益的。据推测，5×FAD肠道或SPF小鼠和移植AD患者粪便的GF小鼠大脑中的C/EBPβ/AEP信号激活部分是由AD患者肠道微生物失调引起的促炎AA代谢物介导的（图2和7）。
SPF和GF小鼠大脑的RNAseq分析显示了几个关键的信号通路与AD病症有关。例如，与GF小鼠相比，胰岛素/IGF-1通路及其下游效应物PI3-激酶/Akt（PKB）和RAS/RAF/MAP激酶等在SFP小鼠中发生了明显的改变（图3）。AD也被称为3型糖尿病（T3D）。在AD患者的大脑中表现出低水平的胰岛素、IR和整体的胰岛素信号传导障碍。另外，T2D糖尿病（T2DM）患者出现轻度认知障碍（MCI）、痴呆或AD的机会增加。此外，AD患者表现出进行性的大脑胰岛素抵抗和胰岛素缺乏。T2DM或肥胖症的动物模型表现出认知障碍。用胰岛素增敏剂或鼻内胰岛素治疗可以改善AD和MCI动物模型以及人类的认知表现。作者认为在AD与HC、GF与SPF小鼠之间作平行比较是不准确的。然而，3×Tg小鼠和野生型小鼠之间的胰岛素信号变化已经被充分研究。大量结果表明，3×Tg小鼠的葡萄糖耐量下降，包括雌性3×Tg小鼠表现出葡萄糖耐量的显著下降，葡萄糖不耐受和皮质淀粉样蛋白途径随着年龄的增长而增加。胰岛素增敏剂的慢性治疗改善了空间学习，并减弱了tau过度磷酸化和神经炎症。先前的研究表明，胰岛素信号传导和C/EBPβ相互调节。例如，胰岛素通过诱导C/EBPβ触发许多应激反应的基因表达。值得注意的是，C/EBPβ通过结合其启动子来介导IGF-1和人类IR的表达。此外，C/EBPβ对于IGF-II介导的记忆增强是必不可少的，PGE2通过激活C/EBPβ上调IGF-1的表达。因此，这些结果支持肠道微生物群可能通过AA代谢物引发大脑中C/EBPβ/AEP途径的激活，导致AD小鼠大脑中胰岛素/IGF-1信号的异常。
代谢组学和HPLC分析表明，在SPF与GF小鼠、AD与HC粪便移植小鼠的大脑和粪便样品中，AA途径的促炎症代谢物显著增多（图4I和5I，（补充图7和11）。该研究结果与以前的研究一致，即与HCs相比，AD患者的粪便样本中AA、PGE2和LKB4等升高，而且在AD模型小鼠和AD患者大脑中AA的代谢也升高。值得注意的是，本研究还发现与AA代谢有关的拟杆菌在移植人类AD粪便样本的GF小鼠中显著增加（图5C-E）。结果表明肠道细菌将AA代谢成PGE2（图5I），PGE2可能由于肠道菌群的失调引发肠漏而进入循环系统。由于3×Tg小鼠的BBB损伤，这些代谢物可能渗透到大脑中，刺激小胶质细胞的激活并引发神经炎症。以前的研究还显示，肠道微生物群破坏了BBB的完整性，导致BBB的泄漏和内毒素的渗透。
一些研究采用代谢组学方法研究了代谢和AD病理学之间的关系。对血清、血浆和脑脊液（CSF）的研究已经确定了许多与疾病有关的涉及胆汁酸、鞘脂、抗氧化剂、磷脂和氨基酸的代谢途径。一些对转基因动物模型和人类的脑组织样本的研究显示，神经递质、氨基酸和抗氧化剂的改变与AD密切相关，AD大脑中的脑多胺代谢增加。多巴胺在移植AD患者肠道菌群的GF小鼠大脑中明显降低（补充图7C和10F），这与以前的报道相一致，即多巴胺在AD患者中降低。除了次级胆汁酸、维生素和苯甲酸盐代谢物外，芳香族氨基酸代谢物的改变表明，与移植健康人群肠道菌群的GF小鼠相比，移植AD患者肠道菌群的GF小鼠的微生物代谢状态和（或）微生物种群发生了改变，这说明移植AD患者粪便改变了GF小鼠的微生物组。戊糖在肠道内通过微生物作用进行代谢，提供碳和能量，戊糖代谢物的改变表明，与移植健康人群肠道菌群的GF小鼠相比，移植AD患者肠道菌群的GF小鼠的微生物代谢和（或）微生物种群的状态发生了改变。此外，糖酵解和TCA循环代谢物的差异表明了葡萄糖利用、能量平衡和排泄的改变。脑磷脂水平较高，加上血清LCFAs和肉碱结合的脂质减少，以及粪便PE脂质增加，说明移植AD患者肠道菌群的GF小鼠的脂质代谢发生了改变（补充图10和11）。鸟氨酸水平的增加可能表明一氧化氮的产生减少，与移植健康人群肠道菌群的GF小鼠相比，移植AD患者肠道菌群的GF小鼠血清中（N-乙酰腐胺）和粪便中（N-氨基甲酰腐胺）的多胺代谢物水平较高，这也说明了这一点。值得注意的是，从以下几类代谢物的变化可以看出，肠道微生物代谢存在差异：芳香族氨基酸代谢物、次级胆汁酸、维生素和苯甲酸盐。此外，碳水化合物和能量代谢物、脂质代谢物、精氨酸代谢物和氧化应激代谢物也存在差异。来自饮食中色氨酸的代谢物硫酸吲哚酚，在移植AD患者肠道菌群的GF小鼠与HC小鼠的血清和大脑中，以及SPF小鼠与HG小鼠的大脑中选择性地升高了（补充图7和10）。它破坏了BBB的完整性，增加了氧化应激，并通过诱导一氧化氮和COX-2、TNFα和IL-6在神经胶质细胞中的增加而促进了神经炎症。它也可能会促进炎症代谢物如PGE2-G渗透到大脑，引发小胶质细胞的激活。
毋庸置疑，肠道菌群促进Aβ或Tau介导的病症的机制很复杂；在本研究中，作者已经确定了一个依赖于肠道微生物影响小胶质细胞的潜在途径。在GF或ABX（抗生素）处理的小鼠中，如果没有微生物群，小胶质细胞的成熟和功能都会受到损害。例如，GF和ABX处理的小鼠的小胶质细胞显示出炎症基因表达谱的明显改变，影响其主要功能并伴随着细胞形态的改变。长期的ABX治疗导致雄性APP/PS1小鼠的Aβ沉积和小胶质细胞形态改变的减少，但雌性APP/PS1小鼠没有变化。本研究显示，与SPF小鼠相比，GF小鼠的小胶质细胞显示出不同的形态（图1F-I），表明GF小鼠的小胶质细胞成熟度受损，这与以前的发现一致。与健康供体相比，用AD患者的粪便样本对GF小鼠进行微生物再移植，激活了小胶质细胞（图6H-K）。SCFAs是微生物群衍生的细菌发酵产物，调节小胶质细胞的稳态。AD患者的肠道中主要产丁酸盐的微生物物种比例较低，如丁酸弧菌和真杆菌属。与没有痴呆症的健康老人相比，AD老人也显示出丁酸酶编码基因的减少。以上发现均与本研究结果一致。与未经处理的小鼠相比，SCFAs处理使GF小鼠的小胶质细胞成熟度增加，加入PGE2-G代谢物后进一步增加了小胶质细胞的激活（图4J-L）。丁酸盐是一种重要的代谢物，是结肠上皮细胞的主要能量来源，它有助于维护肠道屏障，并具有免疫调节和抗炎特性。AD肠道微生物群中缺乏抗炎的丁酸盐生产菌，加上大脑中炎症性PGE2代谢物的升高，会额外增强小胶质细胞的激活，导致慢性神经炎症。这随后激活了C/EBPβ/AEP途径，提高了APP和tau的表达水平，增强了AEP的δ-分泌酶活性，从而导致AD的发病机制。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35017199/
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