Nature 子刊重磅研究：IL-6支持肝细胞体外长期扩增

导读

肝细胞在体外很难扩增。一些研究表明，含有生长因子或Wnt配体的化学混合物可以通过去分化支持肝细胞的长期扩张。但培养条件复杂，能克隆扩增具有完全分化能力的肝祖细胞的报道较少。在此，我们发现IL6与EGF和HGF联合使用，通过将肝细胞转化为诱导的肝祖细胞(IHPC)来促进体外培养的小鼠原代肝细胞的长期扩增(在~150天内传代>30代，理论扩增~1035倍)，从而保持向肝细胞分化的能力。IL6还支持建立单个肝细胞来源的IHPC克隆。下游的STAT3、ERK和AKT途径的总和诱导了许多支持快速生长的转录因子。这种生理学和简单的方法可能为培养以前难以培养的细胞类型提供思路，并支持它们未来的应用。

论文ID

题目：IL6 supports long-term expansion of hepatocytes in vitro

译名：IL-6支持肝细胞体外长期扩增

期刊：Nature Communications                              

IF：17.694

发表时间：2022.11.29

通讯作者单位:中国科学院上海药物研究所

DOI号：https://doi.org/10.1038/s41467-022-35167-8

主要内容

肝脏是哺乳动物的主要代谢器官。在动态平衡期间，肝细胞的周转率通常较低。然而，肝脏在化学、病毒或机械损伤后表现出强劲的再生能力，这归因于肝细胞的立即增殖。小鼠2/3部分肝切除(PHX)后，剩余肝脏仅需1周即可恢复到原来的大小。与体内强大的增殖能力相比，成人肝细胞被证明在体外培养和扩增时极难保持其肝脏特性。由于原代肝细胞在药物毒性和代谢评价中的广泛应用，以及肝细胞治疗在肝病中的潜在应用，寻找体外扩增肝细胞的方法是一项紧迫的任务。

成人肝细胞在肝脏中具有惊人的增殖能力，但在体外培养或扩增非常困难。在这里，我们发现IL6与EGF和HGF结合，可以通过将肝细胞转化为祖细胞，以简单的2D形式支持肝细胞的长期(150天内传代>30代，理论扩增~1035倍)的体外扩增。IL6还支持建立单个肝细胞来源的IHPC克隆。这些IL-6-iHPC可以很容易地分化为成熟的肝细胞，可以挽救移植后的Fah敲除小鼠。这是一种非常接近生理条件的培养基料。0.1 ng/mlIL-6足以诱导原代肝细胞生长，10-30 ng/mlIL-6可支持长期培养。白介素6通常在血清中含量很低，在小鼠中低于1pg/ml，在人类中低于100pg/ml。但肝切除后，小鼠血清IL6可达4 ng/ml，人血清IL6可达0.7 ng/ml，肝脏局部IL6浓度可能更高，因为包括Kupffer细胞在内的肝脏巨噬细胞是IL6的主要来源。

IL6可促进原代肝细胞体外扩增

TNFα是另一种炎性细胞因子，已被发现在肝脏再生中发挥关键作用。敲除TNFα受体(TNFR-KO)或用抗体阻断TNFα均损害小鼠或大鼠肝脏再生。然而，我们发现TNFα在体外促进肝细胞生长的潜力有限。Akerman等人报道了TNFα在肝脏再生中的潜在作用，他们表明TNFα阻断抑制了PHX后循环中IL6水平的增加。PHX后4小时，TNFR-KO小鼠肝脏中的IL6 mRNA比野生小鼠减少了10倍以上，因此NFκΒ和STAT3与DNA结合的增加也没有发生。此外，在TNFR-KO小鼠中，通过注射IL6可以完全正确地降低肝细胞复制和STAT3结合。这些结果表明了肝再生启动的一系列事件:TNFα-NFκB-IL6-STAT3-DNA合成-再生。TNFα已被报道调节巨噬细胞的功能和细胞因子分泌。T N Fα也被发现可以激活Kupffer细胞中的NFκB通路和IL6的产生，从而导致肝细胞中STAT3的激活。结合这些结果和我们的观察，我们清楚地看到TNFα通过促进巨噬细胞和Kupffer细胞产生IL6来促进肝脏再生，而IL6又反过来刺激肝细胞增殖。这可能解释了为什么TNFα能在体内而在体外诱导肝细胞增殖。

IL6支持iHPC长期扩容而不丧失分化能力

我们发现在肝细胞中，IL6主要激活STAT3通路，而EGF/HGF主要激活ERK和AKT通路。阻断这些途径中的任何一个都会导致肝细胞扩张失败，这表明需要对这些途径进行汇总。在此，我们鉴定了一组转录因子，这些转录因子受STAT3、ERK和AKT信号通路的共同调控，位于IL6、EGF和HGF下游。排名前四的是Barx2、Elf3、Mxd3和FOXM1。这四种基因中的任何一种都抑制了IL6-iHPC的生长，而同时敲除这些基因则完全阻止了iHPC在IL6-HCM中的增殖。有趣的是，最近的一项研究报道FOXM1的激活参与了迷走神经-巨噬细胞-肝细胞网络刺激的损伤后肝再生。与FOXM1相比，其他三种转录因子在肝细胞增殖或肝再生中的作用知之甚少。其中，Barx2是Bar类Homeobox基因家族的成员，调节小鼠体内特定细胞黏附分子的转录。据报道，Barx2通过调节卫星细胞的增殖和分化来调节肌肉的生长和修复。Barx2也被报道在卵巢癌中发挥肿瘤抑制作用。Elf3是E-26转录因子家族中的一员，已被认为参与了肝细胞癌上皮细胞向间充质细胞的转化。在NASH诱导的肝损伤中发现Elf3表达上调，并且Elf3也被发现控制与NASH诱导的肝细胞向胆管样肝细胞重编程相关的基因。Mxd3在肝再生中的作用研究较少，但有研究表明，Mxd3作为Mad蛋白家族的一员，在胎儿肝脏中高表达，在成人肝脏中低表达，提示Mxd3可能在肝细胞增殖中起作用。这些基因在体外肝细胞增殖和体内肝再生中的确切作用还有待进一步研究。

IL-6来源的IMHS对Fah敲除小鼠肝脏的再填充作用

我们研究的另一个有趣的发现是，在体外培养系统中，2chepatcell构成了主要的扩张群体。在成年肝脏中，约90%的啮齿动物和50%的人肝细胞是多倍体。据报道，多倍体肝细胞具有增强的功能，包括代谢、蛋白质合成和分泌。在肝再生中，二倍体和多倍体肝细胞都有助于肝再生，但已有研究表明，二倍体肝细胞具有增殖优势，无论是在体外还是在PHX后的肝再生过程中，二倍体肝细胞进入细胞周期的速度和进展速度都快于多倍体细胞。另一方面，在各种肝损伤模型中，也发现多倍体肝细胞在再生过程中会降低倍性。单细胞分析表明，2c-肝细胞中的一个亚群共表达成熟肝细胞标志和HPC标志。二倍体肝细胞与胰岛素的结合也比多倍体细胞强，多倍体细胞是肝脏再生的另一个重要因素。这些研究表明，二倍体和多倍体肝细胞在肝再生过程中都可以增殖。然而，在IL6诱导的肝细胞体外生长中，2c细胞似乎是唯一能在长期培养中增殖的细胞群。在IL6-HCM中培养14天后，FACS分选的2c-细胞数增加了约30倍。FACS分选的4c细胞仅增加了~3倍，其生长可能来源于2c细胞的混合，2c细胞处于G2期，与4c细胞不可分割。8c细胞未见增殖，进一步表明4c细胞可能不会增殖，因为8c细胞在G2期也应该含有少量的4c细胞。需要进行更仔细的研究，以充分阐明在体内和体外观察到的肝细胞生长的差异。

二倍体细胞是IL6-iHPC的主要扩增群体

总结

综上所述，IL6联合EGF和HGF可将原代肝细胞重编程为iHPC进行长期扩增，且不会丧失体外成熟能力。IL6-IMHS在基因表达谱和功能上都与原代肝细胞相似，并且可以重新填充Fah敲除小鼠的几乎整个肝脏并挽救它们。这种生理性、简便的原代肝细胞体外扩增方法可能为培养以前难以培养的细胞类型提供新的思路，并支持其在再生医学中的应用。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41467-022-35167-8

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