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题目：cFLIP suppression and DR5 activation sensitize senescent cancer cells to senolysis
期刊：Nature Cancer
IF：23.177
发表时间：2022年11月22日
通讯作者单位：荷兰癌症研究所
DOI：https://doi.org/10.1038/s43018-022-00462-2
主要内容：
持续的衰老癌细胞具有促进肿瘤的潜力，因此有选择地消除它们是首要的治疗目标。死亡受体抑制剂cFLIP现在已经被证明可以对抗衰老细胞对DR5介导的外源性凋亡的敏感性，这可以被治疗性地利用。
细胞衰老反映了一种稳定的压力诱导的状态转换，它能持久地停止增殖，因此作为一种肿瘤抑制机制而运作。然而，大量的促炎性和通常由核因子κB（NF-κB）驱动的细胞因子的分泌，衰老相关的分泌表型（SASP）和复杂的表观遗传重塑，导致干性细胞的重新编程，在偶尔的细胞周期重新进入后驱动肿瘤的侵略性生长，这些都是与衰老的癌细胞持续存在有关的肿瘤促进特征。因此，钝化SASP的治疗剂（称为衰老剂），或直接以消除持续的衰老细胞为目的的治疗剂（称为衰老剂），作为抗癌治疗策略的一个额外层面，已日益受到关注。这一治疗概念首次被证明对化疗诱导的衰老性淋巴瘤有效。治疗诱导性衰老（TIS）作为第一击，然后是第二击的衰老，这个概念后来被称为 "一击即中 "的概念。近年来，许多药物被认为是抗衰老的候选药物，包括释放针对衰老的T细胞免疫的免疫检查点抑制剂。然而，尽管有临床前模型的证据和早期临床试验的可喜结果，但仍需要确定更多的目标和治疗方法，作为跨癌症实体的广谱有效的衰老剂。
Bernards及其同事使用基于诱导性Cas9的衰老致死性CRISPR筛选，以确定具有衰老潜力的候选基因。具体来说，他们将肺癌细胞暴露在三种抗癌剂中，即极光A抑制剂alisertib、polo样激酶4（PLK4）抑制剂CFI-400945和化疗剂依托泊苷（图1a），随后通过诱导进入TIS的细胞中的Cas9来筛选合成致死基因。在这些筛选中发现的最常见的候选基因是细胞Fas相关死亡域（FADD）-类似白细胞介素（IL）-1β转化酶抑制蛋白（cFLIP）。cFLIP在细胞外死亡途径中阻止caspase 8（CASP8）的激活，是一个NF-κB靶点，以前曾与TIS有关。在alisertib诱导的青春期肝细胞癌和前列腺癌细胞中进行的其他CRISPR筛选也检索到了cFLIP作为一个最热门的弱点。值得注意的是，死亡受体5（DR5）及其配体肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），两者都是促凋亡的NF-κB靶点，在TIS中也被发现上调，表明cFLIP的升高是衰老诱导压力下易死亡细胞的一种反调节生存机制（图1b）。实际上是什么促使这种二元NF-κB控制的 "翻转 "开关走向细胞死亡或生存，目前还不清楚，但额外的转录和翻译后机制可能发挥关键作用。
为了治疗性地利用与衰老相关的DR5表达的增加，在多种癌症细胞系中测试了重组三聚体TRAIL蛋白的衰老潜力，包括肺、乳腺、结肠和肝。激活DR4和DR5能使alisertib诱导的衰老细胞在这些模型中优先凋亡。机制研究特别指出DR5是重组TRAIL触发的衰老的关键媒介。由于TRAIL通过与诱饵受体1和2结合而引起细胞凋亡抑制作用，Bernards及其同事测试了Conatumumab--一种激动性的DR5抗体，实现了与重组TRAIL相当的衰老性杀伤，作为一种更具选择性的方法。重要的是，DR5的激活也优先消除了那些因CFI-400945、依托泊苷或辐射而进入衰老期的癌细胞。而conatumumab和navitoclax（一种B细胞淋巴瘤2（BCL2）和BCL-xL抑制剂，已被广泛探索为一种抗衰老剂）在八个alisertib诱导的衰老细胞系中同样发挥了选择性的细胞毒性，另外六个细胞系在对conatumumab而不是navitoclax的反应中表现出衰老优先的杀伤。
这些结果在体内得到进一步证实，使用肝细胞癌患者衍生的异种移植，以及免疫受损小鼠的肺癌和肝癌细胞系衍生的异种移植模型，表明与单药治疗相比，Aurora A抑制剂加conatumumab的组合对肿瘤的控制效果更好。值得注意的是，在接受联合治疗的小鼠的肿瘤中，具有高水平细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（p21CIP1）表达的细胞被耗尽，这是alisertib诱导的原位衰老的标志。
为了探索对激动性DR5治疗的抗性机制，在cFLIP基因敲除的肝癌细胞中进行了额外的CRISPR筛选。检索到了一些外在凋亡信号组件--包括DR5，但也包括FADD、CASP8和BH3-interacting domain死亡激动剂（BID）。相应地，在alisertib暴露的细胞系中，剥夺这些基因的表达会对conatumumab介导的衰老产生抗性，这表明对死亡受体下游的促凋亡外信号的额外治疗抑制有潜在的好处。
考虑到这一点，并预期与DR5拮抗剂有关的相当大的毒性，作者进行了基于CRISPR-Cas9的协同作用筛选，以确定那些失活的基因会使肺癌细胞对科纳图单抗敏感，从而可以减少剂量。含溴odomain的蛋白2（BRD2）是最热门的基因，将conatumumab与小分子BRD抑制剂NEO2734或基于PROTAC的BRD降解剂相结合，证实了合成致死的互动。在暴露于conatumumab-NEO2734组合的两个非转化细胞系中没有观察到杀伤力，表明其癌症选择性活性，尽管是在没有促生长触发器的情况下测试的。NEO2734处理的细胞的RNA测序分析显示了cFLIP的下调，这可以通过选择性地敲除BRD2而不是BRD4来再现。根据BRD染色质阅读者在衰老过程中的增强器重塑作用，作者假设BRD的抑制会使衰老细胞对cFLIP阻断的细胞死亡敏感。事实上，低剂量的conatumumab和NEO2734在体外和体内对alisertib诱导的癌细胞有深刻的衰老能力。鉴于alisertib诱导的衰老细胞表现出增强的Fas/CD95表达，免疫力低下的小鼠模型可能不能完全再现自然癌症情况下衰老细胞的内源性免疫清除。值得注意的是，使用alisertib、NEO2734和小鼠激动性DR5抗体的组合，在免疫功能正常的合成宿主中繁殖的小鼠肝癌细胞系中也观察到有效的衰老控制；然而，没有提供衰老触发的先天或适应性宿主免疫细胞参与的具体分析。
细胞衰老需要完整的p53和INK4a/ARF（即CDKN2A）等位基因，但携带这些蛋白的遗传缺陷的癌细胞仍可能发生持久的、可能不太稳定的停滞，其特征让人想起衰老。当致癌性Ras在野生型或p53缺失的成纤维细胞中被激活，以测试同样被触发但无衰老能力的模型中的衰老，作者观察到p53受损的细胞基本上不能进入Ras诱导的衰老，并且随后对conatumumab不敏感。鉴于人类癌症和本研究中使用的许多癌症细胞系中失活的p53和CDKN2A突变的频率，它们对DR5拮抗性衰老的疗效的鉴别能力不太清楚。其原因可能是alisertib和所采用的其他药剂即使在p53或CDKN2A基因功能受损的细胞中也会产生一种非经典但对conatumumab敏感的衰老样表型。
最后，作者提出了一个有趣的主张，即TRAIL和SASP因子的旁分泌作用，虽然在这里研究的模型中没有明确诱导旁分泌衰老，但可能驱动非衰老的旁分泌癌细胞的NF-κB反应，从而使它们对DR5激动剂和NEO2734敏感。这种额外的非细胞自主引物可能是有效控制肿瘤的一个重要特征，而不考虑它们对触发性抗癌剂进入细胞衰老的自然异质性能力。
其他具有广泛临床前衰老活性的药物，如黄酮类化合物鱼藤素或槲皮素，以及Bcl2家族抑制剂navitoclax，目前正在进行临床试验，最近发表了用于癌症领域以外的年龄相关疾病的初步有希望的结果。值得注意的是，报告中提到的conatumumab或其他激动性DR5抗体作为单药或与化疗联合使用的疗效是相当令人失望的。同样，探索alisertib的临床研究，尽管其临床前活性令人鼓舞，但产生了适度的活性信号--尽管有许多正在进行的单药或联合试验等待报告。在迄今为止的试验中，DR5激动剂在联合治疗方案中的有限活性尤其令人担忧，因为这些研究包括有可能至少在肿瘤细胞的一个亚群中诱导衰老的化疗化合物。此外，如专题论文所示，非衰老的旁观者癌细胞也应通过增强的NF-κB前馈信号，被分泌的TRAIL和SASP因子引向conatumumab介导的杀伤。同时或连续应用的药物如何在临床上发挥其最佳活性是很复杂的，到目前为止获得的有限的疗效信号可能是由于关于这里提出的senolytic策略的剂量安排不足。此外，目前正在开发更复杂的药物配方，将前驱化疗剂与Conatumumab和黄酮类化合物quercetin相结合。
Bernards及其同事的研究结果通过整合外在的细胞死亡机制、非衰老的旁观者的旁观引力和提供死亡配体的宿主免疫细胞，对潜在的有害衰老癌细胞进行衰老控制，开辟了新的治疗途径。共同的基本原则似乎是高水平的NF-κB通路活动，这在细胞衰老中是构成性的，但也是在许多癌症中由于NF-κB信号异常或过度激活的突变而独立出现的衰老现象。脂多糖诱导的低水平NF-κB不能使细胞对激动性DR5杀伤敏感，而癌症相关的高水平NF-κB活性可能就足够了--可能在非衰老的癌细胞以及衰老的细胞中，正如本研究中非衰老的旁观者的NF-κB激活所证明的那样。这与在本研究中调查的许多细胞系中被认为会损害衰老诱导的p53或INK4a/ARF状态一致。在NF-κB高的癌症中，cFLIP-flop开关被认为是一个关键的反调节器，通过针对BRD管理的cFLIP表达的表观遗传控制，结合激动性死亡受体信号配体，禁用cFLIP-flop开关是一个非常有吸引力的策略。这一想法可能并不完全符合纯粹的 "一举两得的衰老概念"，但可能对许多炎症或其他NF-κB驱动的肿瘤类型具有更广泛的治疗意义，这些肿瘤到目前为止一直是众所周知的难以治疗的。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s43018-022-00462-2
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