武汉大学张兴华/谭志杰发现5-甲基胞嘧啶可稳定DNA但阻碍DNA杂交

5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)是一种重要的DNA修饰物，具有多种生物学功能。众所周知，5mC可以稳定DNA双链。然而，尚不清楚5mC如何影响DNA熔解和杂交动力学。

2022年12月7日，武汉大学张兴华及谭志杰共同通讯在Nucleic Acids Research（IF=19）在线发表题为“5-Methyl-cytosine stabilizes DNA but hinders DNA hybridization revealed by magnetic tweezers and simulations”的研究论文，该研究利用磁镊子和模拟技术发现5-甲基胞嘧啶可稳定DNA但阻碍DNA杂交。该研究发现在恒定的加载速率下，5mC在不同盐分和温度条件下增加了解压缩力，但降低了重压缩力。在恒定的力下，非甲基化DNA在解压缩和重压缩过程中在亚稳态之间跳跃，这意味着低能量障碍。

令人惊讶的是，5mC DNA在完全解压缩后不能重新压缩，除非施加更低的力，在这种情况下，它会随机地以一步的方式重新压缩，这意味着5mC在动力学上阻碍了DNA杂交和DNA杂交中的高能垒。全原子分子动力学模拟表明，5mC在动力学上阻碍DNA杂交的原因是空间效应，而不是由胞嘧啶的额外甲基引起的静电效应。考虑到DNA在复制和转录过程中可能的高速解压缩，该研究的发现为5mC的生物学作用提供了新的见解。

在真核生物中，5mC是最常见的DNA甲基化。在植物中，5mC通常发生在CpG二核苷酸以及CHG和CHH元素上(其中H = A, T或C)。在包括人类在内的哺乳动物中，大多数5mC发生在CpG位点，并通过DNA甲基转移酶DNMT3A和DNMT3B将甲基(CH3)转移到胞嘧啶上而建立新的5mC。5mC可以通过活跃的去甲基化途径被清除，包括将5mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的三个连续步骤。TETs酶将其转化为5-甲酰胞嘧啶(5fC)，然后转化为5-羧基胞嘧啶(5caC)，然后进行碱基切除和碱基切除修复，将碱基位点转化为非甲基化胞嘧啶。

单分子技术已被广泛用于探索5mC对DNA各个方面的影响。除了传统的亚硫酸氢盐测序绘制5mC外，除了单分子水平的DNA测序外，还使用聚合酶动力学和纳米孔直接检测5mC。通过磁镊(MT)平衡测量，作者发现5mC通过增强DNA-DNA吸引来促进高价阳离子诱导的DNA凝结。5mC对DNA弯曲性的影响已被单分子技术广泛研究多年，但5mC如何影响DNA的弯曲性仍然是一个复杂的问题。

MT实验和MD模拟方法（图源自Nucleic Acids Research ）

熔解是双链DNA (dsDNA)在复制和转录过程中最重要的过程之一。众所周知，在热诱导熔解实验中，5mC通常稳定dsDNA，这表明dsDNA的熔解温度升高。因此，甲基化敏感的高分辨率熔解测量已被广泛用于评估从细胞中收集的DNA的5mC水平。在体内，5mC可以降低通过解旋酶和聚合酶分离dsDNA中两条链的速度。除了热和分子马达，dsDNA也可以被外力破坏。单分子操纵实验表明，5mC在力致熔解实验中稳定了dsDNA，表现为短dsDNA剪切剥离力的增加。

尽管关于5mC如何影响dsDNA稳定性的研究广泛，但5mC对DNA熔解和杂交动力学的影响及其机制尚不清楚。单分子操作技术，如MT和光镊已被广泛应用于获得长DNA发夹在接近平衡时的解拉和重拉的时间过程，由于序列依赖的能量势垒，它表现出多个中间状态。在这项工作中用MT实验来描述5mC对DNA熔解和杂交动力学的影响，然后进行全原子MD模拟，揭示了5mC效应的分子机制。

该研究发现在恒定的加载速率下，5mC在不同盐分和温度条件下增加了解压缩力，但降低了重压缩力。在恒定的力下，非甲基化DNA在解压缩和重压缩过程中在亚稳态之间跳跃，这意味着低能量障碍。

令人惊讶的是，5mC DNA在完全解压缩后不能重新压缩，除非施加更低的力，在这种情况下，它会随机地以一步的方式重新压缩，这意味着5mC在动力学上阻碍了DNA杂交和DNA杂交中的高能垒。全原子分子动力学模拟表明，5mC在动力学上阻碍DNA杂交的原因是空间效应，而不是由胞嘧啶的额外甲基引起的静电效应。考虑到DNA在复制和转录过程中可能的高速解压缩，该研究的发现为5mC的生物学作用提供了新的见解。

原文链接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkac1122

转自：“iNature”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！